山豆根地上部分的酪氨酸酶抑制活性成分篩選研究

陽丙媛， 何瑞杰， 王亞鳳， 黃永林

( 廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點實驗室， 廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006 )

壯藥山豆根，為豆科植物越南槐()的干燥根和根莖(王杰，2019)，主要分布于廣西、云南、貴州等地(周思雨等，2021)，現(xiàn)收載于2020版中國藥典，具有清熱解毒，消腫利咽等功效，主治火毒蘊結(jié)、乳蛾喉痹、咽喉腫痛、齒齦腫痛、口舌生瘡(中華人民共和國藥典，2020)。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，對山豆根藥用部位的化學(xué)成分和藥理活性的研究報道較多，分離鑒定出的化合物主要包括生物堿類、黃酮類、三萜類、蒽醌類、酚酸類等(周思雨等，2021；魏鑫等，2021；Hou et al., 2020; 潘其明等，2016；李行諾等，2009)，相關(guān)的藥理活性研究涉及抗腫瘤、抗炎、護(hù)肝等(周思雨等，2021)；而對其地上部分的相關(guān)研究卻鮮有報道。山豆根作為常用中藥材，一般3～4年才能采收(彭紅華等，2014)，生長周期較長；山豆根的藥用部位為其根和根莖，其地上部分被作為非藥用部位丟棄，造成了資源的浪費；地上部分作為山豆根植株不可或缺的重要器官，對其次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、運輸和儲存具有重要意義。因此，探究其地上部分的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和生物活性，對提高山豆根全植株的利用率具有重要意義。本研究以壯藥山豆根的地上部分為研究對象，依托完善的天然產(chǎn)物開發(fā)研究平臺，綜合運用現(xiàn)代色譜分離手段、現(xiàn)代波譜學(xué)方法和現(xiàn)代藥理學(xué)方法，擬探討以下問題：(1)山豆根地上部分包含的化學(xué)成分有哪些；(2)山豆根地上部分含有的化學(xué)成分具有什么生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

山豆根的地上部分于2018年11月采自廣西壯族自治區(qū)百色市那坡縣，經(jīng)廣西大學(xué)的黃榮韶教授鑒定為越南槐()的地上部分，保存于廣西植物功能物質(zhì)與資源持續(xù)利用重點實驗室，標(biāo)本編號為20181103。

1.2 儀器和試劑

500 MHz核磁共振波譜儀(型號：Bruker Avance Ш HD；生產(chǎn)廠家：瑞士布魯克公司)、高速逆流色譜儀(型號：TBE-300C；生產(chǎn)廠家：上海同田生物技術(shù)股份有限公司)、恒流泵(型號：TBP5002 TAUTO；生產(chǎn)廠家：上海同田生物技術(shù)股份有限公司)、恒溫循環(huán)器(型號：TC-1050；生產(chǎn)廠家：上海同田生物技術(shù)股份有限公司)、紫外檢測儀(型號：UV100；生產(chǎn)廠家：賽譜銳思科技有限公司)、真空離心濃縮儀(型號：QUC-23050-J00；生產(chǎn)廠家：英國Genevac公司)、系統(tǒng)控制器(型號：CBM-20A；生產(chǎn)廠家：日本島津公司)、脫氣機(型號：DGU-20A5；生產(chǎn)廠家：日本島津公司)、高效液相色譜儀(型號：LC-20AT；生產(chǎn)廠家：日本島津公司)、光電二極管陣列檢測器(型號：SPD-M20A；生產(chǎn)廠家：日本島津公司)、分析天平(型號：XS205 DualRange；生產(chǎn)廠家：瑞士蘇黎世梅特勒-托利多集團)、電噴霧質(zhì)譜(型號：BRUKER HCT；生產(chǎn)廠家：美國布魯克道爾頓公司)、高分辨質(zhì)譜(型號：LCMS-IT-TOF；生產(chǎn)廠家：日本島津公司)、多功能熒光酶標(biāo)儀(型號：SP-MAX3500FL；生產(chǎn)廠家：上海閃譜生物科技有限公司)。

甲醇(生產(chǎn)廠家：西隴化工股份有限公司)；20×PBS(生產(chǎn)廠家：北京索萊寶科技有限公司)；左旋多巴、曲酸和L-酪氨酸酶(生產(chǎn)廠家：上海源葉生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離 山豆根地上部分(莖和葉)7.8 kg，切成小段后用70%乙醇浸泡提取3次，每次7 d，將提取液合并后減壓濃縮至無醇味，再依次使用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將各萃取部分溶液旋干稱重，分別得到石油醚部位浸膏(30 g)、乙酸乙酯部位浸膏(90 g)、水部位浸膏(400 g)。取乙酸乙酯部分浸膏經(jīng)MCI gel CHP 20P(8.0 cm × 25.0 cm)柱層析，使用甲醇-水(0%～100%，)梯度洗脫，再經(jīng)薄層色譜(TLC)檢測合并得到7個組分FrB1-7。

FrB1(25.8 g)首先由C(5.0 cm × 16.0 cm)柱層析分離，甲醇-水(0%～100%，)梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測，合并相同組分后得到亞組分FrB11-114。FrB13經(jīng)反復(fù)Sephadex LH-20柱(2.0 cm × 25.0 cm)，以二氯甲烷-甲醇(1∶1，)為流動相，分離得化合物(6 mg)；FrB110經(jīng)半制備型HPLC，以甲醇-水(86∶14，)洗脫，分離得化合物(6 mg)。FrB2(12.4 g)經(jīng)Diaion HP20SS柱、Sephadex LH-20柱得到化合物(14 mg)。FrB3(9.8 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析、半制備型HPLC得到化合物(12 mg)和化合物(56 mg)。FrB4(6.5g)經(jīng)Diaion HP20SS柱、Chromatorex C柱得到化合物(5 mg)和化合物(19 mg)。FrB6(13.7 g)由Sephadex LH-20、硅膠柱，純化得到化合物(25 mg)、化合物(24 mg)、化合物(33 mg)。

1.3.2 酪氨酸酶抑制實驗 酪氨酸酶的抑制活性測定參考已報道的方法(Takashi et al., 1997)，以磷酸緩沖液為溶劑，左旋多巴為底物(1 mg·mL)，曲酸為陽性對照，蘑菇酪氨酸酶配制成100 U·mL。實驗分為4個組：樣品組、樣品背景對照組、空白組、空白對照組。

先向96孔板中依次加入樣品溶液20 μL和酪氨酸酶溶液10 μL，每個樣品孔均設(shè)置3個復(fù)孔做平行對照，混合均勻后置于37 ℃水浴中孵育10 min，接著加入40 μL的左旋多巴溶液，繼續(xù)于37 ℃水浴中孵育5 min后，于475 nm波長下測定吸光度值，得到樣品組吸光度值；以10 μL的磷酸緩沖液(PBS)替代10 μL的酪氨酸酶溶液，重復(fù)以上步驟，測得樣品背景對照組吸光度值；以20 μL的PBS替代20 μL的樣品溶液，測得空白組吸光度值；以30 μL的PBS替代20 μL的樣品溶液和10 μL的酪氨酸酶溶液，測得空白對照組吸光度值。所有試驗均重復(fù)3次。

按照如下公式計算酪氨酸酶抑制率，即：

抑制率= [1-(-)/(-)]×100%。

使用Statistical Product and Service Solutions軟件處理，計算出相對應(yīng)的IC值，試驗數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物白色粉末。HR-ESI-MS: 139.039 6 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Acetone-): 7.88 (1H, dd,=7.8, 1.7 Hz, H-6), 7.50 (1H, dt,=7.8, 1.7 Hz, H-4), 6.96～6.86 (2H, m, H-3, 5);C-NMR (125 MHz, Acetone-): 172.5 (-COOH), 162.7 (C-2), 136.5 (C-4), 131.1 (C-6), 119.8 (C-5), 117.8 (C-1), 113.1 (C-3)。通過與文獻(xiàn)(王丹等，2019)對比，確定化合物為水楊酸。

化合物白色針狀結(jié)晶。HR-ESI-MS: 139.039 3 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Acetone-): 7.90 (2H, d,=8.7 Hz, H-2, 6), 6.91 (2H, d,=8.7 Hz, H-3, 5);C-NMR (125 MHz, Acetone-): 167.7 (-COOH), 162.6 (C-4), 132.7 (C-2, 6), 122.6 (C-1), 115.9 (C-3, 5)。通過與文獻(xiàn)(謝雪等，2016)對比，確定化合物為對羥基苯甲酸。

化合物黃色針晶。HR-ESI-MS m/z: 287.068 2 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 12.94 (1H, s, 5-OH), 7.38～7.40 (2H, m, H-2′, 6′), 6.89 (1H, d,= 8.9 Hz, H-5′), 6.63 (1H, s, H-3), 6.43 (1H, d,=2.1 Hz, H-8), 6.18 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6)；C-NMR (125 MHz, DMSO-): 181.8 (C-4), 164.3 (C-2), 164.1 (C-9), 172.5 (C-7), 157.5 (C-5), 149.8 (C-3′), 145.9 (C-4′), 121.7 (C-6′), 119.1 (C-1′), 116.2 (C-5′), 113.5 (C-2′), 103.9 (C-3), 103.0 (C-10), 99.0 (C-6), 94.0 (C-8)。通過與文獻(xiàn)(張艷麗等，2014)對比，確定化合物為木犀草素。

化合物黃色針晶。HR-ESI-MS: 355.119 7 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Methanol-): 8.06 (2H, d,=8.9 Hz, H-2′, 6′), 6.88 (2H, d,=8.9 Hz, H-3′, 5′), 6.20 (1H, s, H-6), 5.30～5.08 (1H, m, H-2″), 3.45 (2H, d,=6.7 Hz, H-1″), 1.78 (3H, s, H-4″), 1.66 (3H, s, H-5″);C-NMR (125 MHz, Methanol-): 177.5 (C-4), 162.7 (C-7), 160.4 (C-5), 160.0 (C-4′), 155.4 (C-9), 147.9 (C-2), 136.9 (C-3), 132.4 (C-3″), 130.7 (C-2′, 6′), 124.1 (C-1′), 124.1 (C-2″), 116.3 (C-3′, 5′), 107.6 (C-8), 104.5 (C-10), 98.8 (C-6), 25.9 (C-4″), 22.5 (C-1″), 18.2 (C-5″)。通過與文獻(xiàn)(楊瑞云等，2010)對比，確定化合物為8-異戊烯基山萘酚。

化合物黃色粉末。HR-ESI-MS: 303.025 4 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Methanol-): 7.72 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2′), 7.61 (1H, dd,= 8.5, 2.2 Hz, H-6′), 6.87 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5′), 6.37 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.17 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6);C-NMR (125 MHz, Methanol-): 177.3 (C-4), 165.7 (C-7), 162.4 (C-9), 158.2 (C-5), 148.8 (C-2), 148.0 (C-4′), 146.2 (C-3′), 137.2 (C-3), 124.2 (C-1′), 121.7 (C-6′), 116.2 (C-5′), 116.0 (C-2′), 104.5 (C-10), 99.3 (C-6), 94.5 (C-8)。通過與文獻(xiàn)(王呈文等，2014)對比，確定化合物為槲皮素。

化合物白色粉末。HR-ESI-MS: 255.065 8 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 8.17 (1H, s, H-2), 7.93 (1H, d,=8.8 Hz, H-5), 7.33 (2H, d,=8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (1H, m, H-8), 6.82 (1H, d,=2.7 Hz, H-6), 6.79 (2H, d,=8.5 Hz, H-3′, 5′);C-NMR (125 MHz, DMSO-): 175.4 (C-4), 162.9 (C-7), 157.9 (C-9), 157.5 (C-4′), 153.3 (C-2), 130.5 (C-2′, 6′), 128.6 (C-5), 124.0 (C-3), 123.0 (C-1′), 117.0 (C-10), 115.7 (C-3′, 5′), 115.5 (C-6), 102.5 (C-8)。通過與文獻(xiàn)(周杰等，2013)對比，確定化合物為大豆素。

化合物淡黃色粉末。HR-ESI-MS: 431.134 5 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 8.36 (1H, d,=6.5 Hz, H-2), 8.04 (1H, dd,=8.9, 2.1 Hz, H-5), 7.49 (2H, d,=8.7 Hz, H-2′, 6′), 7.21 (1H, d,=2.1 Hz, H-8), 7.15 (1H, dd,=8.9, 2.1 Hz, H-6), 6.97 (2H, d,=8.7 Hz, H-3′, 5′), 5.08 (1H, d,=7.1 Hz, H-1″), 3.76 (3H, s, 4′-OCH)；C-NMR (125 MHz, DMSO-): 175.2 (C-4), 161.7 (C-7), 159.4 (C-4′), 157.4 (C-9), 153.9 (C-2), 130.3 (C-2′, 6′), 127.3 (C-5), 124.1 (C-1′), 123.8 (C-3), 118.8 (C-10), 116.0 (C-6), 114.0 (C-3′,5′), 103.8 (C-8), 100.3 (C-1″), 77.4 (C-5″), 76.6 (C-3″), 73.4 (C-2″), 70.1 (C-4″), 61.0 (C-6″), 55.5 (4′-OCH)。通過與文獻(xiàn)(鄭善松等，2011)對比，確定化學(xué)物為芒柄花素-7---D-葡萄糖苷。

化合物黃色針晶。HR-ESI-MS: 269.046 5 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 8.32 (1H, s, H-2), 7.97 (1H, d,=8.8 Hz, H-5), 7.50 (2H, d,=8.8 Hz, H-2′, 6′), 6.98 (2H, d,=8.8 Hz, H-3′, 5′), 6.94 (1H, dd,=8.8, 2.3 Hz, H-6), 6.87 (1H, d,=2.3 Hz, H-8), 3.78 (3H, s, OCH);C NMR (125 MHz, DMSO-): 174.7 (C-4), 162.6 (C-7), 159.0 (C-4′), 157.5 (C-9), 153.1 (C-2)，130.1 (C-2′, 6′)，127.3 (C-5), 124.3 (C-1′)，123.2 (C-3), 116.6 (C-10), 115.2 (C-6), 113.7 (C-3′, 5′), 102.1 (C-8), 55.3 (4′-OCH)。通過與文獻(xiàn)(畢丹等，2018)對比，確定化合物為刺芒柄花素。

化合物白色針晶。HR-ESI-MS: 301.071 0 [M+H]。H-NMR (500 MHz, Methanol-): 8.05 (1H, s, H-2), 7.37 (2H, d,= 7.5 Hz, H-2′, 6′), 6.84 (2H, d,= 7.5 Hz, H-3′, 5′), 6.44 (1H, s, H-8), 3.87 (3H, s, 6-OCH);C-NMR (125 MHz, Methanol-): 182.5 (C-4), 158.9 (C-5), 158.7 (C-4′), 155.0 (C-7), 154.8 (C-9), 154.6 (C-2), 132.9 (C-6), 131.4 (C-2′, 6′), 124.2 (C-1′),123.3 (C-3), 116.3 (C-3′, 5′)，106.7 (C-10), 95.0 (C-8), 60.9 (6-OCH)。通過與文獻(xiàn)(邱鷹昆等，2006)對比，確定化合物為鳶尾黃素。

化合物淡黃色針狀結(jié)晶。HR-ESI-MS: 271.060 8 [M+H]。H-NMR (500 MHz, DMSO-): 12.94 (1H, s, OH-5), 8.26 (1H, s, H-2), 7.33 (2H, d,= 8.6 Hz, H-2′, H-6′), 6.84 (2H, d,= 8.6 Hz, H-3′, H-5′), 6.36 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8), 6.21 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6);C-NMR (125 MHz, DMSO-): 180.3 (C-4), 164.3 (C-7), 162.1 (C-4′), 157.7 (C-5), 157.5 (C-9), 153.9 (C-2), 130.2 (C-2′, 6′), 122.4 (C-1′), 121.3 (C-3), 115.2 (C-3′, 5′), 104.6 (C-10), 99.0 (C-6), 93.7 (C-8)。通過與文獻(xiàn)(向槿等，2020)對比，確定化合物為金雀異黃素。

2.2 酪氨酸酶抑制活性測試結(jié)果

以“1.3.2”所述方法測定化合物、和的酪氨酸酶抑制活性，測試結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，與陽性對照相比，化合物表現(xiàn)出較強的酪氨酸酶抑制活性，IC值為(1.58±0.31)×10mol·L；化合物對酪氨酸酶的抑制作用與陽性對照相當(dāng)；化合物對酪氨酸酶的抑制作用稍弱于陽性對照。

表 1 酪氨酸酶抑制活性的測試結(jié)果Table1 Results of tyrosinase inhibitory activity

3 討論與結(jié)論

研究顯示，一些中藥的非藥用部位與其藥用部位具有相似的化學(xué)成分和療效，可作為替代藥物入藥。例如，補益藥人參的傳統(tǒng)藥用部位為干燥根和根莖，而其非藥用部位葉因含有相同的有效成分人參皂苷Rg1和人參皂苷Re，同樣具有補氣生津的功效，已被收載于中國藥典(中華人民共和國藥典，2020)。一些中藥的非藥用部位與其藥用部位具有不同化學(xué)成分和生物活性，可為藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)研究支持。例如，活血化瘀藥西紅花的傳統(tǒng)藥用部位為干燥柱頭，有效成分為西紅花苷，而其非藥用部位含有黃酮、多酚、皂苷、生物堿等多種化學(xué)成分，具有抗炎、抗氧化、降血壓和保肝等作用(陳娜和楊濱，2018)。一些中藥的非藥用部位可用于制造化妝品、食品、獸藥等(趙暉和苗明三，2019)。由此可見，中藥的非藥用部位具有巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景；同時，利用好非藥用部位，能避免藥材資源的浪費，有利于實現(xiàn)中藥資源的可持續(xù)發(fā)展。具有清熱解毒功效的山豆根，其藥用部位為根和根莖，有效成分為苦參堿和氧化苦參堿(中華人民共和國藥典，2020)，而本研究首次闡明了山豆根地上部分含有黃酮類和酚酸類化合物，并發(fā)現(xiàn)這類化合物具有較好的酪氨酸酶抑制活性，是潛在的酪氨酸酶抑制劑。以上研究結(jié)果揭示了山豆根地上部分的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及其生物活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用山豆根的非藥用部位提供了科學(xué)依據(jù)。