microRNA-45調(diào)控魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡*

童細焱 趙泰成

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）又稱震顫麻痹，是一種多發(fā)于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)致密帶腹外側部的多巴胺能神經(jīng)元大量變性和進行性缺失，以及神經(jīng)元胞漿中Lewy 小體形成為特征性病理改變。神經(jīng)疾病現(xiàn)在是全球殘疾的主要來源，而世界上增長最快的神經(jīng)疾病是帕金森病。隨著社會老齡化，預計到2040 年將達到1 200 萬以上[1-2]。PD 的研究已有190 多年，但其病因及致病機制仍未徹底明確，目前可能的相關因素有老齡化、環(huán)境工業(yè)和農(nóng)業(yè)污染、遺傳因素、線粒體功能障礙、氧化應激和泛酸-蛋白酶體系統(tǒng)功能異常等[3]。

miRNA-451 是近年發(fā)現(xiàn)的一種多功能miRNA，目前已證實其在血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)發(fā)育、心血管疾病及腫瘤等方面具有重要作用。研究者在對帕金森病輕度認知障礙患者的血漿外泌體miRNA 篩選分析中發(fā)現(xiàn)miRNA-451 在帕金森患者血漿外泌體中的表達明顯高于健康對照組[4]。但是miRNA-451在PD 發(fā)生與進展中的作用機制尚不明確。

本研究以魚藤酮處理PC12 細胞建立的帕金森病細胞模型為研究對象，通過瞬時轉染技術，在PC12 細胞損傷模型中分別抑制和增強miRNA-451的 表達，采用Real-time PCR 檢測miRNA-451對Bcl-2、Bax 的表達水平的影響，旨在分析miRNA-451 對帕金森病細胞模型凋亡的影響，為以miRNA-451 為靶點的帕金森病治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12 細胞系購買于凱基生物技術股份有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（四季青）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco 公司）；魚藤酮（rotenone）、二甲基亞砜（Sigma 公司）；miRNA-451模擬物（miRNA-451 mimics）、miRNA-451 抑制劑（miRNA-451-inhibitor）、無義序列及實時熒光定量PCR 所需引物（均由上海生物工程有限公司合成）；總RNA 提取試劑盒（北京TIANGEN 公司提供）；Lipofectamine 2000、Trizol 試劑（invitrogen 公司）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa 公司）。RT 反應使用新加坡ABI2720 型PCR 儀，PCR 檢測采用杭州博日FQD-96A Realtime PCR system 進行。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和藥物配置 PC12 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，每隔2～3 天用0.125%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞實驗。魚藤酮用二甲基亞砜（DMSO）配制成1 mmol/L 儲存液于常溫避光保存，然后稀釋成所需濃度使用。

1.3.2 MTT 法篩選魚藤酮最佳處理濃度 收集對數(shù)期PC12 細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為5×104/mL，96 孔板中每孔加入100 μL，置5% CO2、37 ℃條件培養(yǎng)箱中12 h，至細胞融合度達80%時，每孔加入100 μL 不同濃度的魚藤酮（0、0.01、0.1、1、10、100 μmol/L），均設5 個復孔。于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL，5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄除培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液，加入DMSO 溶液150 μL/孔，置恒溫搖床上低速搖勻10 min，至結晶顆粒完全溶解。利用酶聯(lián)免疫檢測儀，波長OD 570 nm 條件下測量吸光值。計量公式：細胞存活率（%）=（OD 實驗組/OD 對照組）×100%。

1.3.3 PC12 細胞損傷模型的建立 將PC12 細胞接種于96 孔板中，濃度為5×104/mL，待細胞融合80%后棄去培養(yǎng)液，加入含魚藤酮（1 μmol/L）的DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即可造成損傷模型。

1.3.4 分組與轉染 魚藤酮處理后，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h 進行轉染。采用LipofectamineTM2000 轉染試劑盒，按說明書步驟進行細胞轉染。轉染時將1×105/mL 密度的PD 細胞模型接種于6 孔板中。實驗分為四組：陰性對照抑制劑組（PD 細胞模型+inhibitor-無義序列，inhibitor-NC組）、miRNA-451 抑制劑組（PD 細胞模型+miRNA-451-inhibitor，miRNA-451-inhibitor組）、陰性對照模擬物組（PD 細胞模型+mimics-無義序列，mimics-NC組）及miRNA-451 模擬物組（PD 細胞模型+miRNA-451-mimics，miRNA-451-mimics組）。

1.3.5 Real-time PCR 檢測miRNA-451、Bcl-2、Bax的表達水平轉染效率的檢測：細胞轉染后繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，收集各組細胞，采用Trizol 試劑提取細胞總RNA，按試劑盒說明書分別進行cDNA 合成和以miRNA-451 和U6 引物進行Real-time PCR 檢測，設立3 個復孔，以U6 作為內(nèi)參。Bcl-2、Bax 表達水平檢測：提取各組細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，以Bcl-2、Bax 引物進行Real-time PCR 檢測，設立3個復孔，以GAPDH 作為內(nèi)參。Real-time PCR 的結果用2-ΔΔCt計算。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR中所需引物序列

1.4 統(tǒng)計學處理 實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用（）表示，使用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT 法篩選魚藤酮最佳處理濃度 0～100 μmol/L魚藤酮處理PC12 細胞24 h 后，PC12 細胞存活率隨著濃度的增高逐漸下降，呈濃度依賴性，細胞存活率以相對于載體的百分比來測量。1 μmol/L 魚藤酮干預后細胞存活率為（49.4±3.0）%，與0 μmol/L魚藤酮相比存活率降低（P＜0.05），見表2，圖1。在后續(xù)實驗中采用魚藤酮的濃度為1 μmol/L。

表2 MTT法檢測魚藤酮對PC12細胞活力的影響

圖1 魚藤酮對PC12細胞活力的影響

2.2 細胞轉染效率 在PC12 細胞損傷模型中轉染miRNA-451 模擬物或抑制劑72 h 后，Realtime PCR 檢測miRNA-451 的表達，與inhibitor-NC組（miRNA-451 表達量為1）相比，miRNA-451-inhibitor組miRNA-451 的表達量（0.27±0.05）明顯降低（P＜0.01）；與mimics-NC組（miRNA-451表達量為1）相比，miRNA-451-mimics組中miRNA-451 的表達水平（12.95±2.33）明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 miR-451的表達水平

2.3 Real-time PCR 檢測Bcl-2 和Bax mRNA 表達水平 miRNA-451-mimics組Bcl-2 mRNA 表達下調(diào)（P＜0.05），miRNA-451-inhibitor組Bcl-2 mRNA表達上調(diào)（P＜0.01）。miRNA-451-mimics組Bax mRNA 表達上調(diào)（P＜0.01）；miRNA-451-inhibitor組Bax mRNA 表達下調(diào)（P＜0.05）。見表3，圖3。

表3 各組Bcl-2和Bax的mRNA表達水平（）

表3 各組Bcl-2和Bax的mRNA表達水平（）

*與GAPDH 比較，P＜0.05；**與GAPDH 比較，P＜0.01。

圖3 Bcl-2和Bax mRNA表達水平

3 討論

PD 是一種緩慢進展的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病初期若能及時診斷并給予正確治療，多數(shù)患者發(fā)病數(shù)年內(nèi)仍能有較好的生活質(zhì)量或繼續(xù)工作。PD被認為是一種病因不明的多病因疾病，特征性臨床癥狀包括運動癥狀（靜止性震顫、動作遲緩和肌強直等）和非運動癥狀（認知障礙、嗅覺障礙、睡眠障礙等）。隨著社會老齡化，PD 的致殘率和癡呆率逐年上升，患者的生活質(zhì)量明顯下降，并給患者的家庭及社會造成巨大負擔。近年來在病理生理學和對癥治療方面已經(jīng)取得了許多進展，但仍有一些至關重要的問題有待解決，其中最主要的是如何改變疾病進展。但目前的治療方法無法改變疾病的進展，因此PD 的防治研究應引起廣泛重視[5-6]。

魚藤酮是植物毛魚藤的有效成分，目前被廣泛用作殺蟲劑，作為一種特效的線粒體復合物Ⅰ抑制劑，通過抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞，導致細胞線粒體功能喪失，細胞氧化應激增強，最終誘導細胞凋亡，長期接觸可引起多巴胺神經(jīng)退行性病變。線粒體功能障礙是PD 發(fā)病的關鍵機制[7]。因此，魚藤酮常用于PD 研究的動物和細胞模型建立[8-9]。

PC12 細胞是一種來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，具有神經(jīng)分泌（兒茶酚胺、多巴胺和去甲腎上腺素）、離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)受體的功能[10]。在常規(guī)條件下可作為一種兒茶酚胺樣細胞，具有增殖細胞的一些特性。但在神經(jīng)生長因子的誘導下可增殖和分化為神經(jīng)元樣細胞，具有神經(jīng)元相似的形態(tài)、生理和生化功能，而且在常規(guī)條件下易于培養(yǎng)，因此PC12 細胞廣泛應用于神經(jīng)生物學模型[11-12]。

miRNA-451 位于人類17 號染色體上的一種雙順反子miRNA 基因位點，主要在紅細胞中高度表達，其余組織和細胞中表達較低。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451 是一種腫瘤增殖的調(diào)節(jié)子，其不僅可以抑制多種腫瘤細胞的增殖而且能通過抑制腫瘤細胞分化來促進腫瘤細胞凋亡[13-15]。近年來研究者報道阿爾茨海默病、帕金森病和抑郁癥等疾病中也存在著miR-144/451 的表達異常[16]。帕金森病病理主要表現(xiàn)為多巴胺能神經(jīng)元的大量退化和進行性缺失。而神經(jīng)元的死亡主要有凋亡、自噬性死亡和壞死幾種形式。因此推測miRNA-451 可能與帕金森病的神經(jīng)元凋亡有關[17-19]。

Bcl-2 是哺乳動物中重要的抗凋亡基因，Bax 是與Bcl-2 功能相對的基因，其不但能拮抗Bcl-2 的抑制凋亡作用，而且有直接促進細胞凋亡的功能；Bcl-2 和Bax 基因之間的平衡在細胞凋亡過程中有重要的調(diào)控作用[20-21]。

本研究通過魚藤酮處理腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12 細胞，構建PD 細胞模型。將miRNA-451-mimic、miRNA-451-inhibitor 轉入魚藤酮損傷后的PC12 細胞模型中，采用Real-time PCR 檢測各組細胞中Bcl-2 和Bax mRNA 的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)，miRNA-451-mimics組Bcl-2 mRNA 表達下調(diào)、Bax mRNA 表達上調(diào)，而miRNA-451-inhibitor組Bcl-2 mRNA 表達上調(diào)、Bax mRNA 表達下調(diào)。因此，推測miRNA-451 可以通過抑制Bcl-2、上調(diào)Bax mRNA 的表達來促進魚藤酮誘導的PC12 細胞損傷模型凋亡。然而，miRNA-451 調(diào)控魚藤酮誘導的帕金森病細胞模型凋亡的具體通路還需要進一步實驗來驗證。