固定化混合菌對陜北黃土地區石油污染土壤的修復效果

花莉，成濤之，梁智勇

陜西科技大學環境科學與工程學院，陜西 西安 710021

陜北地區石油資源豐富，是中國西北地區重要的能源化工基地。但油田大多位于黃土高原的丘陵、河壑區，植被差、水土流失嚴重，原油的污染對本來就十分脆弱的自然環境造成了非常嚴重的危害（馬健波等，2021；許殷瑞等，2021）。微生物降解是土壤有機污染徹底礦化的主要途徑，是一項重要的土壤修復措施。有效增加土壤中高效石油降解菌的數量和活性是微生物修復成功應用的關鍵技術（Abena et al.，2019；屈撐囤等，2016；王娣等，2020）。固定化微生物技術，利用載體材料提供的微環境，克服了直接接種時游離菌不能適應惡劣的土壤條件和復雜的自然環境、難以同土著菌競爭等缺陷，能向土壤添加高濃度和高活性的污染物降解菌，具有明顯的修復土壤優勢（Zhu et al.，2017；San et al.，2020；任靜等，2020）。固定化微生物的載體是影響固定化微生物活性、穩定性及污染物去除效果的重要因素。理想的固定化載體應具有對微生物細胞無毒、傳質性能好、不易被微生物分解；并能耐受由于生物繁殖引起的破裂；透氣性和透光性良好、強度高、壽命長、價格低廉、材料容易獲得等特點（Wu et al.，2021）。

中國特別是西北地區為小麥的主要產區，農業秸稈來源廣泛，容易獲得，價格低廉。因此利用廢棄秸稈作為吸附材料有著重大的現實意義。生物質炭富含C、N等營養元素，表面攜帶大量官能團，能顯著改善土壤理化條件，其多孔性質有利于微生物的附著生長（卜曉莉等，2014）。利用生物質炭固定微生物在農業中已有廣泛應用，但關于其在石油污染土壤修復方面的應用目前少有報道，有待深入研究。因而秸稈和生物質炭是固定化載體的重要潛在選擇。吸附-包埋聯合固定化技術（Vecino et al.，2013）是一種重要的組合固定技術，不僅實現高濃度的微生物固定和較強的固定化強度，同時由于吸附過程載體材料提供的微環境和營養物質，很好地解決了包埋過程微生物失活的問題。吸附-包埋聯合固定化技術，已經在許多研究中被作為主要的固定化方法。

本論文以麥稈（馬驍軒等，2016）、生物質炭、活性炭為吸附載體制備固定化微生物顆粒，研究固定化混合菌對實際石油烴污染土壤的修復效果。所用材料均無二次污染產生，對土壤微生物群落結構有一定改善效果，且可以在某種程度上控制溫室氣體的排放（Meyer et al.，2012；Xu et al.，2016；Zhang et al.，2016）。對投加固定化混合菌修復的石油污染土壤進行微生物種群多樣性分析，以此比較3種固定化載體的優劣，獲得最適合固定化混合菌生長的載體材料；通過對石油污染土壤中微生物群落的種群結構動態變化進行解析，揭示微生物群落演變的規律，反映生態環境和外界脅迫對微生物群落的影響，為調控和優化固定化微生物群落、評估修復效果提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 固定化混合菌修復石油污染土壤實驗

1.1.1 供試菌種

前期研究篩選的固定化混合菌生物學分類如下：

Rp：屬于植生拉烏爾菌（Raoultella planticola），γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），變形菌門（Proteobacteria）。

Sm：屬于粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens），γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），變形菌門（Proteobacteria）。

Bc：屬于蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），芽孢桿菌綱（Bacilli），厚壁菌門（Firmicutes）。

Kv：屬于變棲克雷伯氏菌（Klebsiella variicola），γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），變形菌門（Proteobacteria）。

1.1.2 固定化修復實驗

分別選取投加秸稈固定化混合菌、生物質炭固定化混合菌和活性炭固定化混合菌修復第42天的石油污染滅菌組土樣分別記為A-1、A-2、A-3和未滅菌組土樣分別記為B-1、B-2、B-3進行分析實驗。實驗土壤來自延安某油田。土樣理化性質：pH 8.73，含水率4.74%，有機質7.48 g·kg-1，速效磷42.27 mg·kg-1，全氮0.95 g·kg-1，石油烴14720 mg·kg-1。將制備的秸稈、生物質炭、活性炭固定化混合菌按20%（體積分數）的添加量加入石油污染土壤樣品中進行生物修復模擬實驗（圖1）。以游離菌和不加菌液為對照組。土壤分高溫高壓（121 ℃，0.15 MPa，12 h）滅菌組和未滅菌組作不同處理。放置于30 ℃恒溫箱中避光培養，隨時補加無菌水，使土壤水分保持在30%左右，每天深翻土壤以保證土壤透氣性良好。實驗過程中分別在0、1、3、5、7、14、21、28、35、42 d時以四分法取土樣，每個處理3個平行。土壤石油烴的測定采用質量法（溫傳忠等，2011）。降解率計算方法如公式（1）所示。

其中，b0為臨界截面周長；d為板的有效截面高度；Jc為臨界截面的類似極慣性矩；My為板柱間的不平衡力矩；V為剪力；vu為臨界截面名義剪應力；vn為外力作用下的最大剪應力 ；x為臨界截面上任意點的坐標；γ為考慮臨界剪切假定的有截面偏心彎矩的板柱間剪力傳遞系數，方柱取0.4。φ為強度折減系數，取1.0。

石油烴降解率：

式中：

m0——空白培養液中殘余石油質量（g）；

mx——測試培養液中殘余石油質量（g）。

1.2 修復過程土壤微生物群落結構研究

1.2.1 總DNA提取及PCR擴增

利用土壤 DNA提取試劑盒 CW2091（北京康為世紀生物科技有限公司）提取各樣品總DNA，經0.5%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，提取DNA放置在-20 ℃保存。對細菌16S rDNA基因進行擴增，選用的細菌通用引物為27F/1492R（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R： 5′-TACCTTGTTACGACTT-3′）。擴增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 個循環；72 ℃ 7 min（Blackwood et al.，2003；袁三青等，2007）。PCR擴增產物用1%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳進行分離，并用DNA純化試劑盒回收純化。

1.2.2 限制性酶切及基因掃描

采用HaeⅢ和Hha I兩種限制性內切酶分別對PCR產物進行酶切。DNA片段掃描由上海基康生物技術有限公司完成。DNA片段掃描結果分析軟件為GeneMarkerV 2.2.0。

1.2.3 基于T-RFLP圖譜的微生物多樣性分析

以T-RFLP圖譜中每一個限制性片段（T-RF）為一個操作單元OTU（Operational Taxonomic Unit），以相對峰面積（每個T-RF的峰面積除以累計峰面積）作為OTU豐度，進行多樣性指數計算，包括Simpson指數（J）、Shannon-Wiener指數（H′）、Brillouin 指數（H）、McIntosh指數（Dmc）和均勻度指數（E），聚類方法選擇組間平均距離法。選擇在線分析中的T-RFLP Analysis（APLAUS+）程序，上傳酶切結果，對土壤樣品中出現的優勢T-RFs進行定性分析。

2 結果與討論

2.1 修復土壤石油降解率變化

滅菌組各處理土樣中石油烴降解率如圖2a所示。處理42 d時，投加菌劑土樣石油烴的降解率遠高于未投加菌劑土樣；投加固定化混合菌土樣降解率遠高于投加游離混合菌土樣（32.3%）。空白滅菌土壤，隨時間的延長石油烴降解率基本不變，最高僅為5.9%，這可能主要歸因于石油烴的揮發或少量土著菌的降解。投加游離混合菌組降解率隨時間的延長而增加，降解42 d后32.2%的石油烴被去除，與空白滅菌土壤相比，石油烴的降解去除明顯是因為投加的混合菌的作用。游離混合菌組降解率在21 d后基本保持穩定，這是由于在生物修復前期，油量豐富，促使微生物大量生長繁殖，石油烴組分降解速度快，隨著時間的推移，易降解的石油烴組分被大量消耗，殘留物主要為難降解組分，因此表觀降解速率相對穩定（Pacwa-P?ociniczak et al.，2014；Wu et al.，2019）。投加生物質炭、活性炭固定化混合菌顆粒的土壤在7 d時降解率分別為22.14%、30.19%，高于秸稈固定化混合菌的14.61%和游離混合菌降解率15.84%。表明生物質炭和活性炭有很強的吸附傳質性能，使混合菌充分接觸營養物質，快速適應環境從而發揮高效除油能力（張又弛等，2015）。相比之下，秸稈固定化混合菌致密的表面結構使營養物質傳遞性差，使得固定化顆粒內部混合菌營養不易獲得；而游離菌需要適應石油污染土壤，石油降解菌活性不高。然而，秸稈固定化混合菌在14 d后降解率增長速度明顯提高，可能是脲酶參與的有效氮增加有利于土壤中微生物的生長，也為微生物參與石油烴的降解提供了更為充足的營養條件；同時秸稈的添加促進了石油烴降解菌的生長，并使其對污染物的降解得到強化。修復42 d時土壤中降解率大小順序為秸稈固定化混合菌54.92%＞生物質炭固定化混合菌50.23%＞活性炭固定化混合菌47.05%＞游離菌32.2%＞空白對照5.87%。表明隨時間的延長，投加固定化混合菌的土壤脲酶活性總體呈增長趨勢，投加游離菌和空白對照組，脲酶活性基本變化不大，后期有遞減趨勢。

圖2 石油污染土壤修復過程中石油烴降解率變化Figure 2 Changes in degradation rate of petroleum hydrocarbons during remediation of petroleum-contaminated soil

由圖2b可知，在3種不同載體固定化混合菌修復石油污染土壤中，投加生物質炭固定化混合菌的修復效果最好，活性炭固定化混合菌次之，秸稈固定化混合最低。固定化混合菌修復污染土壤效果優于游離混合菌修復效果。空白污染土樣中石油烴的表觀降解率同樣隨時間的延長逐漸增大，降解42 d后12.03%的石油烴被去除，其主要原因是石油烴中易揮發組分的揮發及土壤中土著微生物對石油烴的去除。空白石油滅菌組對石油烴的降解率5.87%，而土著微生物為6.16%。0—7 d，生物質炭固定化混合菌土壤中石油降解率呈拋物線增長，活性炭固定化混合菌土壤中石油降解率呈線性增長，秸稈固定化混合菌土壤降解率出現S型增長。推測主要原因是生物質炭具有強吸附能力和良好的混合菌生長棲息空穴，土著微生物的干擾能力相對較弱，能較好的吸附降解石油（Zhu et al.，2017）；活性炭同樣具有較強吸附能力但活性炭孔隙固定化微生物數量較前者少，外加環境因素的負效應，表現出降解率線性增長；秸稈內部微生物只能棲息在表面，對土著菌和外界環境刺激反應敏感（程揚等，2018）。后期固定化顆粒石油烴表觀降解率隨時間的推移而不斷上升。42 d時測得不同投加菌源的石油降解率分別為：空白對照組 12.03%、游離菌組21.05%、秸稈固定化菌組37.16%、生物質炭固定化菌組54.19%、活性炭固定化菌組46.03%。生物質炭固定化混合菌的降解效率最高，對石油污染環境適應性最強，在修復中更能儲存營養物質供微生物后期生長，同時給微生物提供適宜的生長空間，避免有毒有害物質的侵害。而秸稈固定化混合菌因無法抵御土著菌種的激烈競爭，使得石油降解混合菌生長可能受到抑制，石油降解率相對較低。

2.2 修復過程土壤微生物群落結構變化

2.2.1 生物多樣性指數分析

許殷瑞等（2021）和楊茜等（2015）的研究表明土壤pH、含水率、總石油烴和總有機碳等理化性質是影響陜北油田區石油污染土壤微生物種群結構的關鍵因素。本研究根據末端限制性片段的數目和相對峰高值，分別計算了6個樣品中細菌多樣性指數（表1）。滅菌組石油污染土壤中辛普森集中度指數 J（Simpson）、香儂指數 H（Shannon-Wiener）、Brillouin指數和Dmc（McIntosh）指數數值一致呈下降趨勢，說明A-1投加秸稈固定化混合菌的石油修復土壤中有更豐富的微生物多樣性。從均勻度指數看，各物種的豐度差異明顯。A-3均勻度指數最低，這與楊萌青等（2013）研究一致，隨著石油降解率降低，污染殘留濃度增加，微生物群落多樣性指數降低，菌落分布不均勻。未滅菌組樣品B-2多樣性指數都是最高的。說明在土著菌存在的激烈競爭中，生物質炭固定化混合菌修復土壤中微生物多樣性最豐富，生物炭固定可以為污染土壤微生物生長提供良好的棲息環境，有利于石油烴降解菌的定殖與生長。

表1 不同處理下石油污染土壤微生物多樣性指數Table 1 Microbial diversity indices of petroleum-contaminated soil under different treatments

2.2.2 微生物群落組成變化

本研究通過對投加固定化混合菌的石油污染土壤進行微生物群落結構分析，以此比較3種固定化載體的優劣，獲得最適合固定化混合菌生長的載體材料。通過比對石油污染土壤的細菌構建 16S rDNA克隆文庫，可以發現，石油污染土壤修復42 d后土壤微生物群落主要包括放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、產水菌門（Aquificae）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、纖維桿菌門（Fibrobacteress）、棲熱菌門（Thermus）等8類菌門（表2）。其中厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是投加固定化混合菌所屬的主要菌門。

表2 不同固定化載體修復石油污染土壤中細菌群落變化表（菌門水平）Table 2 Changes in bacterial communities in petroleumcontaminated soil remediated by different immobilized carriers (phylum level) %

滅菌組土壤樣品A-1、A-2、A-3中厚壁菌門在克隆文庫中含量分別為3.21%、2.25%、1.32%，變形菌門在克隆文庫中含量分別為0.52%、3.12%、0.49%。生物質炭固定化A-2組厚壁菌門和變形菌門總含量最高5.37%，說明滅菌組土壤中生物質炭最適合厚壁菌門和變形菌門微生物生長。未滅菌組石油污染土壤中樣品B-2含有厚壁菌門0.48%、變形菌門 3.25%、放線菌門 6.60%、擬桿菌門 1.95%等，微生物菌的物種豐富且均勻。在未滅菌組石油污染土壤中厚壁菌門和變形菌門總含量大小順序為樣品 B-2 (0.48%、3.25%)＞樣品 B-3 (0.23%、2.46%)＞樣品B-1 (0.16%、1.38%)。土著優勢菌的放線菌門與擬桿菌門總和大小順序為：樣品 B-2(8.55%)＜樣品 B-3 (15.89%)＜樣品 B-1 (16.86%)。說明生物質炭固定化混合菌修復石油污染土壤最具優勢，不僅提供給高效混合菌良好的生長條件，同時減弱土著菌種的激烈競爭干擾。

3 結論

（1）經42 d石油污染土壤修復后，滅菌組石油烴降解率表現為秸稈固定化混合菌＞生物質炭固定化混合菌＞活性炭固定化混合菌＞游離菌＞空白對照；未滅菌組的降解率為生物質炭固定化菌組＞活性炭固定化菌組＞秸稈固定化菌組＞游離菌組＞空白對照組。

（2）秸稈固定化混合菌修復滅菌組石油污染土壤和生物質炭固定化混合菌修復未滅菌組石油污染土壤的群落結構相似，微生物多樣性豐富，群落分布均勻。

（3）生物質炭固定化混合菌最適宜厚壁菌門和變形菌門生長，這兩類微生物為石油烴的降解提供了保障。