不同地區(qū)花色腐乳真菌多樣性分析

趙恒，陳富安，趙慧君，王玉榮，郭壯，張振東*

(1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.谷城農(nóng)韻土特產(chǎn)品開發(fā)有限公司，湖北 襄陽 441053)

腐乳也被稱為“東方奶酪”，是一種發(fā)酵豆制品，其歷史最早可追溯到三國(guó)時(shí)期[1]。由于腐乳獨(dú)特的風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，通常被用作日常調(diào)味，每年在中國(guó)的產(chǎn)量可達(dá)300萬噸[2]。根據(jù)制作腐乳所使用的微生物類型，腐乳可被分為毛霉型(包括根霉、毛霉)腐乳、細(xì)菌型腐乳(用芽孢桿菌或者微球菌發(fā)酵)、自然發(fā)酵型腐乳(發(fā)酵過程中未人工接種特定的微生物)。根據(jù)腐乳的色澤與風(fēng)味，又可以將腐乳分為紅方腐乳、青方腐乳、白方腐乳、醬腐乳、花色腐乳等[3]。

近年來，由于高通量測(cè)序技術(shù)的成本低、通量高、可以快速產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，且可以避免培養(yǎng)條件的限制，能客觀地反映微生物多樣性，被用于分析微生物的群落結(jié)構(gòu)，該技術(shù)也被引入對(duì)腐乳的研究[4]。類似其他類型的發(fā)酵食品[5-7]，腐乳中常見的微生物有霉菌(包括毛霉、根霉等)、酵母(包括裂殖酵母、假絲酵母、畢赤酵母)，細(xì)菌有乳球菌屬、四球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和短桿菌屬[8-9]。這些微生物可以通過代謝作用，代謝蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、有機(jī)酸、酯類等產(chǎn)生呈味小分子化合物。然而，不同地區(qū)制作腐乳的工藝與加工環(huán)境的差異，使得不同地區(qū)與不同類型的腐乳微生物多樣性差別均較大。不同腐乳的微生物差異大多與化學(xué)特征相關(guān)聯(lián)，例如鹽度、乙醇含量和一些營(yíng)養(yǎng)元素含量，而微生物的代謝作用又能影響腐乳化學(xué)成分的組成，導(dǎo)致不同腐乳的風(fēng)味差異。

湖北襄陽市茨河鎮(zhèn)與恩施州利川地區(qū)出產(chǎn)的花色腐乳風(fēng)味較好，遠(yuǎn)近聞名，可能蘊(yùn)含獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)，然而對(duì)其研究尚少。因此，本研究以采集到的利川和茨河花色腐乳為研究對(duì)象，基于高通量測(cè)序技術(shù)分析這兩個(gè)地區(qū)腐乳的菌群結(jié)構(gòu)，并對(duì)它們的菌群進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花色腐乳：茨河與利川花色腐乳,分別采集自湖北省襄陽市谷城市茨河鎮(zhèn)和恩施市利川縣。

試劑：引物SSU0817F/SSU1196：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；dNTPs Mix、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、5×PrimeSTAR Buffer：寶生物工程(大連)有限公司；E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒：美國(guó)Omega Bio-Tek公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Vetiri型梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司；WD-9413B型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；ND-2000C型微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品分別采集于湖北省襄陽市谷城市茨河鎮(zhèn)和恩施市利川縣，且不同編號(hào)樣品采集于不同商家或者農(nóng)戶家中。首先取無菌瓶裝入無異味的花色腐乳樣品，然后放入樣品箱中，迅速帶回微生物實(shí)驗(yàn)室備用。茨河腐乳14個(gè)樣品編號(hào)記錄為CH1～CH14，利川腐乳8個(gè)樣品編號(hào)為L(zhǎng)C1～LC8。

1.3.2 腐乳樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增與高通量測(cè)序

腐乳樣品的DNA提取使用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒，按照說明書進(jìn)行。將提取到的DNA使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，參照Li等[10]的方法，以真菌18S核糖體小亞基RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)817～1196區(qū)帶有barcode的通用引物SSU0817F與SSU1196進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序與體系均參照Li等的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳儀與微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，然后在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于Illumina MiSeq第二代測(cè)序平臺(tái)完成測(cè)序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

將MiSeq測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的原始序列基于Qiime 1.9.2平臺(tái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析[11]，大致步驟如下：首先去掉低質(zhì)量序列，使用FLASH將雙末端序列基于重疊區(qū)域合并，去掉接頭；按照97%的相似度使用UCLUST聚類產(chǎn)生分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)，使用UCHIME去掉嵌合體，使用RDP分類器基于Silva的18S 核糖體RNA數(shù)據(jù)庫對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行分類鑒定。使用QIIME平臺(tái)自帶程序計(jì)算腐乳樣品的α與β多樣性。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析與作圖

使用非參數(shù)克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test)對(duì)組件差異進(jìn)行檢驗(yàn)；使用R包vegan v2.5-7(https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)進(jìn)行非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析與非參數(shù)多元方差分析(PerMANOVA)分析；使用R包randomForest v4.6-14進(jìn)行隨機(jī)森林分析(https://cran.r-project.org/web/packages/randomForest/)。文中所有圖使用Origin V8.5或者R包ggplot2完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐乳微生物多樣性分析

本研究共采集了22個(gè)腐乳樣品，分別來自茨河鎮(zhèn)(n=14)和利川市(n=8)，以真菌的18S序列為靶點(diǎn)，進(jìn)行MiSeq測(cè)序，將低質(zhì)量序列去除，去掉嵌合體后，共得到630條和234條序列，茨河的腐乳樣品平均27585條，而來自利川的腐乳平均每個(gè)樣品30504.88條序列(見表1)。經(jīng)過分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類后，茨河腐乳樣品平均得到623個(gè)OTU，而利川腐乳樣品平均得到286個(gè)OTU。然后選擇每個(gè)OTU的序列進(jìn)行鑒定，兩個(gè)地區(qū)的腐乳樣品得到平均的分類單元相近，結(jié)果見表1。

表1 茨河與利川花色腐乳樣品的序列與微生物多樣性

續(xù) 表

對(duì)來自襄陽市茨河鎮(zhèn)和恩施市利川縣的腐乳樣品α多樣性進(jìn)行了計(jì)算，當(dāng)測(cè)序深度為20010條時(shí)，香濃曲線變得平緩，表明當(dāng)前樣品的測(cè)序數(shù)量能夠反映實(shí)際樣品菌群結(jié)構(gòu)。兩個(gè)地區(qū)腐乳樣品的α多樣性指數(shù)的分析結(jié)果見圖1。

圖1 茨河和利川兩地腐乳α多樣性

由圖1可知，采集自茨河的腐乳樣品的Chao1指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種指數(shù)顯著高于利川腐乳樣品，而它們之間的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)沒有顯著差異，表明這兩個(gè)地區(qū)的腐乳真菌多樣性存在差異，茨河腐乳物種豐富度較高，后續(xù)進(jìn)一步通過菌群分析來明確其差異的真菌物種組成。

2.2 腐乳群體結(jié)構(gòu)分析

將相對(duì)含量大于1%的分類單元定義為優(yōu)勢(shì)分類單元。對(duì)兩地的腐乳樣品真菌分析見圖2。采集自茨河的樣品共有3個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，分別為子囊菌門(Ascomycota，82.75%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota，10.63%)、毛霉菌亞門(Mucoromycotina，5.76%)，而利川腐乳樣品共有2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，分別是子囊菌門(90.34%)、擔(dān)子菌門(8.78%)，由此可知子囊菌門是茨河與利川腐乳樣品共有的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門。使用克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test)，結(jié)果表明，茨河與利川腐乳樣品間的這3個(gè)菌門的相對(duì)含量差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 茨河與利川花色腐乳優(yōu)勢(shì)門組成

對(duì)兩個(gè)地區(qū)的花色腐乳進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)來自茨河的腐乳樣品共有9個(gè)優(yōu)勢(shì)屬：Galactomyces(37.80%)、畢赤酵母屬 (Pichia，25.32%)、德巴利酵母屬(Debaryomyces，6.45%)、巴克斯霉屬(Backusella，5.57%)、絲孢酵母屬(Trichosporon，5.32%)、假絲酵母屬(Candida，4.70%)、Guehomyces(4.63%)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces，4.06%)、鐮刀菌屬(Fusarium，1.14%)；而利川腐乳樣品優(yōu)勢(shì)屬為Galactomyces(31.25%)、德巴利酵母屬(Debaryomyces，28.20%)、畢赤酵母屬(Pichia，10.95%)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces，9.53%)、絲孢酵母屬(Trichosporon，5.02%)、曲霉屬(Aspergillus，3.96%)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia，2.83%)、鐮刀菌屬(Fusarium，1.78%)、假絲酵母屬(Candida，1.41%)。

圖3 茨河與利川花色腐乳優(yōu)勢(shì)屬組成

盡管茨河和利川花色腐乳都有9個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，但是它們的優(yōu)勢(shì)屬組成并不相同，茨河腐乳與利川腐乳相比少了節(jié)擔(dān)菌屬，而利川腐乳與茨河腐乳相比少了巴克斯霉屬。真菌是腐乳發(fā)酵制作過程中起主要作用的微生物菌種之一[12]，然而目前報(bào)道較少。石黎琳等[13]對(duì)重慶地區(qū)的腐乳分析表明，腐乳成品中優(yōu)勢(shì)真菌為子囊菌門(Ascomycota)，優(yōu)勢(shì)真菌屬為鏈格孢屬(Alternaria)和赤霉菌屬。另一項(xiàng)針對(duì)毛霉型腐乳的研究顯示[14]，假絲酵母屬、毛霉屬、曲霉屬、絲孢酵母屬和紅曲霉屬為優(yōu)勢(shì)真菌。紅腐乳成品中優(yōu)勢(shì)真菌為紅曲霉屬和曲霉屬[15]。湖南白溪腐乳的優(yōu)勢(shì)真菌為地霉菌屬(Geotrichum)和被孢霉屬(Mortierella)。由此可見，不同地區(qū)及類型的腐乳中真菌類群差異很大，而花色腐乳與這些腐乳相比，優(yōu)勢(shì)真菌的數(shù)量更多，菌群組成更為多樣，且值得注意的是，花色腐乳中相對(duì)含量最高的優(yōu)勢(shì)屬為Galactomyces，在其他腐乳中并未報(bào)道過。

Galactomyces在利川與襄陽的花色腐乳中都是主要真菌。該屬一些真菌如Galactomycescandidum，Galactomycesgeotrichum等是常見的腐敗霉菌，能在牛乳和奶酪等乳制品及一些釀造酒中被分離到，因此這些種能在較低的pH和水分活度的環(huán)境中生存，也有研究將這種霉菌與其他真菌一起使用來制作奶酪。原因是該菌能降解奶酪中的苦味肽，減少奶酪的苦味，還能形成大量的風(fēng)味物質(zhì)[16-17]和一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如維生素B2、麥角甾醇和海藻糖[18]，因此該屬一些種是食品發(fā)酵的重要菌種。然而，該菌也能引起食品的腐敗和植物病害，是常見的腐敗菌[19]。因此，我們推測(cè)，Galactomyces可能含有豐富的蛋白酶和肽酶，能適應(yīng)腐乳這種較低水分活度的環(huán)境，并可能對(duì)腐乳特殊風(fēng)味的產(chǎn)生具有重要的作用，遺憾的是目前針對(duì)該菌對(duì)富含植物蛋白的發(fā)酵食品的作用研究尚少。

相對(duì)含量排在Galactomyces之后的真菌是畢赤酵母屬和德巴利酵母屬，在利川與茨河花色腐乳中的相對(duì)含量都超過了5%。德巴利酵母和畢赤酵母通常能從食品、土壤、水、植物和一些感染的臨床樣本中分離到。畢赤酵母屬和德巴利酵母屬都屬于油脂酵母，能在細(xì)胞內(nèi)積累油脂，少數(shù)德巴利酵母能在細(xì)胞內(nèi)積累自身生物量20%～70%的油脂，因此能耐受高滲環(huán)境，如在含有高達(dá)4 mol/L氯化鈉和5%葡萄糖的培養(yǎng)基和食物中生長(zhǎng)[20-21]。腐乳中常見的畢赤酵母屬、德巴利酵母和威克漢姆酵母屬也是亞洲和非洲谷物發(fā)酵食品中起到主要作用的微生物類群，有助于改善不含酒精類發(fā)酵食品的滋味、風(fēng)味、酸度、消化性和質(zhì)構(gòu)[22]。

基于非參數(shù)的克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test)對(duì)這兩個(gè)地區(qū)的優(yōu)勢(shì)真菌屬的相對(duì)含量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，茨河與利川兩個(gè)地區(qū)的腐乳樣品間3個(gè)菌屬的相對(duì)含量存在顯著差異，它們分別是曲霉屬、巴克斯霉屬和威克漢姆酵母屬。茨河腐乳中的曲霉屬、威克漢姆酵母屬的相對(duì)含量顯著低于利川腐乳，而茨河腐乳中的巴克斯霉屬相對(duì)含量則極顯著高于利川腐乳樣品。我們基于兩個(gè)地區(qū)的真菌OTU表，利用Bray-Curtis距離矩陣進(jìn)一步做了非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析。

2.3 茨河與利川腐乳菌群差異分析

由茨河與利川的物種多樣性與菌群組成分析可知，這兩個(gè)地區(qū)的腐乳菌群在屬水平上存在差異，進(jìn)一步對(duì)茨河與利川腐乳樣品基于OTU相對(duì)含量進(jìn)行非度量多維尺度分析，結(jié)果見圖4。

圖4 茨河與利川花色腐乳NMDS(a)與隨機(jī)森林分析(b)

由圖4中a可知，茨河腐乳樣品與利川腐乳樣品呈現(xiàn)分離的趨勢(shì)，且沒有交集產(chǎn)生，進(jìn)一步證實(shí)了兩地腐乳菌群結(jié)構(gòu)的差異。同時(shí)通過非參數(shù)多元方差分析(PerMANOVA)證實(shí)了茨河與利川腐乳樣品菌群組成差異顯著(P<0.05)。由圖4中b可知，使用隨機(jī)森林分析尋找屬水平上導(dǎo)致茨河地區(qū)與利川地區(qū)菌群差異的標(biāo)志物種。結(jié)果顯示，導(dǎo)致兩個(gè)地區(qū)腐乳樣品菌群差異的主要菌屬有巴克斯霉屬、曲霉屬和威克漢姆酵母屬。前面的統(tǒng)計(jì)分析顯示茨河與利川腐乳樣品間這3個(gè)真菌屬的相對(duì)含量存在差異。結(jié)合圖4中b，它們的貢獻(xiàn)度中巴克斯霉屬最高，曲霉屬次之，緊接著是威克漢姆酵母屬。

巴克斯霉屬在進(jìn)化關(guān)系上與毛霉相近，該屬目前有14種水平的分類單元，其分離來源多數(shù)為土壤、落葉和食草動(dòng)物的糞便[23-24]。值得注意的是，本研究首次從發(fā)酵食品腐乳中發(fā)現(xiàn)大量存在這種菌，該屬微生物多數(shù)能以葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，但僅部分種能利用蔗糖。腐乳富含植物蛋白，然而目前尚沒有關(guān)于巴克斯霉對(duì)于蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的代謝研究，也沒有該菌對(duì)食品品質(zhì)的研究。

3 結(jié)論

襄陽市茨河與利川花色腐乳的真菌多樣性具有顯著差異，它們的共同優(yōu)勢(shì)菌門為子囊菌門和擔(dān)子菌門，共同優(yōu)勢(shì)屬為Galactomyces、畢赤酵母屬、德巴利酵母屬、絲孢酵母屬、假絲酵母屬、Guehomyces、威克漢姆酵母屬和鐮刀菌屬。對(duì)茨河與利川腐乳菌群差異貢獻(xiàn)度最高的3個(gè)真菌屬為巴克斯霉屬、曲霉屬和威克漢姆酵母屬，可能是兩者風(fēng)味差異的重要因素。