云南小粒咖啡果皮果膠酶提取工藝的優化及其結構表征

李澤林，李夢月，趙春燕，高燕，鄔文君，范江平，沈曉靜,2,3*

(1.云南農業大學 食品科學技術學院，昆明 650201；2.昆明醫科大學云南省天然藥物藥理重點實驗室，昆明 650500;3.云南農業大學 理學院，昆明 650201)

咖啡目前被超過80個國家種植，是茜草科(Rubiaceae)、咖啡屬(Coffea)植物，主要分布于中美洲、非洲、亞洲等地[1]。咖啡中含有大量的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、咖啡因等生物活性化合物，是世界上最受歡迎的飲料之一[2]。近年來，中國咖啡消費量逐年增加，是世界上最大的咖啡潛在的消費市場。云南小粒咖啡因其“濃而不苦、香而不烈、略帶果味”的獨特風味而備受消費者和國際咖啡市場喜愛[3]。咖啡果皮作為咖啡生產加工過程中第一副產物，其產量隨著咖啡消費的增加而日益增長。據報道，在云南小粒咖啡的生產過程中，每年需處理的果皮殘渣約39.68萬噸[4-5]，這些咖啡果皮除部分用作堆肥[6]或用于制作咖啡果皮茶[7]、果酒[8]等產品外，絕大部分仍被作為廢棄物丟棄，因而造成環境污染和資源浪費。近年來，有研究者提出從咖啡果皮中提取果膠，以達到分解咖啡果皮的目的，最終使其經濟效益和實際使用價值增加。

果膠是一種廣泛存在于高等植物初級細胞壁和細胞之間區域的酸性雜多糖，多為半乳糖醛酸及其衍生物[9-10]。因其具有良好的凝膠性、吸附性、乳化性、增稠性等，在食品工業中常被用作凝膠劑、增稠劑、乳化劑、穩定劑等[11-12]。此外，果膠結構和組成比較特殊，具有抗腫瘤[13]、降血糖[14]、調節腸道菌群、提高免疫力[15]以及調節慢性疾病等功能。目前，果膠的提取方法主要有酸提法、離子交換法、微波提取法、鹽析法、酶法等[16]。因此，從咖啡果皮中提取果膠一方面將解決咖啡生產中大量果皮帶來的環境問題，另一方面提取的果膠可用于食品、醫藥領域，滿足市場需求。

現有研究顯示熱水法提取的咖啡果膠具有較好的抑菌和抗氧化作用[17-18]。本研究擬在單因素試驗的基礎上，采用響應面設計優化云南小粒咖啡果皮果膠的酶法提取工藝，并通過傅里葉紅外光譜檢測粗果膠的官能團組成，旨在為云南小粒咖啡果皮的綜合利用及果膠產品的開發提供理論依據和前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南小粒咖啡果皮(阿拉比卡)：云南省保山市潞江壩；纖維素酶(10000 U/g)：瑪雅試劑有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市風船化學試劑科技有限公司；pH計電極保護液：上海雷磁儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-48型打粉機 寧波新芝生物科技有限公司；Nexus 470 FTIR型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；SHZ-D(III)型循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9070A型電熱鼓風干燥機 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

將咖啡果皮在45 ℃鼓風干燥箱中干燥至含水率低于5%，打粉，過80目篩，備用。準確稱取20 g咖啡果皮干粉，在pH 5.0下加入纖維素酶水解后過濾得到濾液，旋轉蒸發將其濃縮至原體積的1/4，加入等體積的乙醇過夜沉淀，離心分離留沉淀，取少量蒸餾水溶解后真空冷凍干燥，計算果膠得率。

1.4 果膠提取單因素試驗

1.4.1 提取時間對果膠提取率的影響

考察提取時間對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、pH 為5.0和料液比為1∶20，設置酶解時間分別為1，2，3，4，5 h，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.2 酶添加量對果膠提取率的影響

考察酶添加量對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定提取溫度為50 ℃、pH為 5.0、酶解時間為3 h和料液比為1∶20，設置纖維素酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.3 pH值對果膠提取率的影響

考察pH對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、酶解時間為3 h和料液比為1∶20，設置pH分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.4 料液比對果膠提取率的影響

考察料液比對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、pH為 5.0和酶解時間為3 h，設置料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.4.5 提取溫度對果膠提取率的影響

考察提取溫度對咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、pH為 5.0、酶解時間為3 h和料液比為1∶20，設置提取溫度分別為35，40，45，50，55 ℃，對果皮果膠進行酶提取，測定果膠提取率。

1.5 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，以果膠提取率為指標，選取pH、提取溫度、酶添加量和料液比4個因素，通過四因素三水平響應面分析法進行響應面優化試驗(見表1)，得到最佳酶提取工藝。

表1 響應面試驗因素水平設計

1.6 紅外光譜檢測

準確稱取咖啡果膠樣品1 mg，采用KBr壓片法進行檢測，在500～4000 cm-1范圍內進行掃描。

1.7 數據處理

所有試驗均重復3次，數據以平均值±標準差表示。采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計與分析，利用Origin 2020作圖。

2 結果與分析

2.1 果膠提取單因素試驗結果與分析

單因素試驗結果見圖1。

圖1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對果膠提取率的影響

由圖1中a可知，隨著提取時間的增加，咖啡粗果膠提取率隨之上升；當提取時間為3 h時，提取率達到最大值(8.31±0.36)%；超過3 h后，果膠提取率降低，原因可能是提取時間過長，酶活性下降，導致果膠提取率變低。因此，提取3 h為最優時間。

2.1.2 酶添加量對果膠提取率的影響

由圖1中b可知，當酶添加量從0.5%增加到1.0%時，粗果膠提取率迅速達到最大值(9.4±0.79)%，但是當酶添加量大于1.0%時，提取率出現逐漸下降的趨勢，可能是因為反應底物在酶添加量為1.0%時剛好酶解完全，隨著酶添加量的增加可能起到相反的效果。因此，酶添加量1.0%為最優值。

2.1.3 pH值對果膠提取率的影響

由圖1中c可知，隨著酶解液pH的增加，果膠提取率在pH值為5.0時達到最大值(10.1±0.97)%；pH值大于5.0，提取率降低。表明pH 5.0是纖維素酶的最適pH值，能夠最大限度釋放咖啡果膠。

2.1.4 料液比對果膠提取率的影響

由圖1中d可知，料液比為1∶20時，果膠提取率達到最大值(9.0±0.56)%；料液比大于1∶20時，提取率降低，原因是液體過少時反應不充分，液體過多時稀釋了酶濃度使酶活力下降。因此，1∶20為最佳料液比。

2.1.5 提取溫度對果膠提取率的影響

溫度是影響酶活性最重要的條件之一。由圖1中e可知，提取溫度由35 ℃上升到50 ℃時提取率持續增加，并且在50 ℃時達到最大值(10.42±0.87)%；但是當提取溫度大于50 ℃時，果膠提取率降低，原因是溫度升高抑制了酶活性，從而降低了提取率。因此，溫度為50 ℃時最適宜。

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗結果

響應面優化試驗設計與結果見表2，以果膠提取率(Y)為考察響應指標，建立其與pH(A)、提取溫度(B)、酶添加量(C)和料液比(D)的回歸模型，得到二次多項回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及結果

續 表

Y=8.00-8.333E-003A-0.30B+0.50C+0.37D+0.40AB+0.38AC-0.95AD-1.31BC-0.65BD+0.100CD-2.01A2-1.00B2-0.81C2-0.79D2。

由表3可知，對回歸模型方差進行分析， 回歸模型顯著(P<0.05)，模型決定系數R2=0.7318>0.7，說明模型與實際試驗擬合良好，該擬合方程能較好呈現出果膠提取率與各因素間的關系。失擬項不顯著(P>0.05)，說明響應面優化得到的最佳提取工藝具有可行性。模型中，一次項A、B、C、D，交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD，二次項A2、B2、C2、D2對粗果膠提取率均有影響，但是只有BC(P<0.05)和A2(P<0.01)具有顯著性，根據F值可以得出各因素對提取率的影響順序為酶添加量>料液比>提取溫度>pH。

表3 回歸模型方差分析及模型顯著性檢驗

續 表

2.2.2 交互作用分析

根據回歸分析結果制作相應的等高線圖和響應面曲線圖，見圖2。

圖2 各因素交互作用對果膠得率影響的三維曲面和等高線

隨著提取溫度的升高，咖啡果膠提取率呈現先升高后下降的趨勢；隨著pH的增加，咖啡果膠提取率也呈現先升到最大值后緩慢下降的趨勢。pH(A)與提取溫度(B)的等高線圖接近圓形，說明兩因素的交互作用不顯著，但是相互影響(見圖2中a)。隨著酶添加量的增加和pH的增大，果膠提取率逐漸升高，達到最高值后呈下降趨勢，pH(A)與酶添加量(C)的等高線圖接近圓形，說明兩因素的交互作用不明顯(見圖2中b)。隨著酶添加量的增加，果膠提取率緩慢增大，在達到最大值后迅速降低；隨著提取溫度的增加，果膠提取率先迅速升高到最大值之后逐漸降低；由酶添加量和提取溫度的等高線圖可知，等高線沿著酶添加量軸密集且呈橢圓形，說明提取溫度(B)和酶添加量(C)的交互作用顯著(P<0.05)(見圖2中c)。隨著料液比(D)和酶添加量(C)的增加，咖啡果膠提取率增大，但是兩者交互作用不顯著(見圖2中d)，這些結果與前人的研究報道相似[19-20]。綜上所述，各因素對咖啡果膠的提取率均相互影響，但是只有提取溫度(B)和酶添加量(C)的交互作用顯著，影響提取的主次順序為酶添加量>料液比>提取溫度>pH。

2.2.3 模型驗證

通過模型優化確定咖啡果膠的最佳工藝條件：提取溫度為45 ℃，溶劑pH 為4.9，酶添加量為1.5%及料液比為1∶24.65，理論上得到咖啡果膠提取率為9.18%。以上預測最優的工藝條件重復3次試驗，得到實際的咖啡果膠提取率為(10.30±1.28)%，與理論預測值接近且無顯著差異，可見該模型能較好地預測和模擬試驗中咖啡果膠的提取率。

2.3 紅外光譜結果分析

圖3 云南小粒咖啡果皮果膠的紅外光譜

3 結論

本研究優化了云南小粒咖啡果皮中果膠的提取工藝，表征了所得粗果膠的結構。結果表明，云南小粒咖啡果皮果膠的最優酶提取工藝條件為提取溫度45 ℃、pH 4.9、酶添加量1.5%及料液比1∶24.65，提取率為9.18%。紅外光譜表明，咖啡果膠是具有典型多糖結構的酸性雜多糖。本研究將為云南小粒咖啡果皮果膠的開發利用提供試驗基礎和參考依據。