冰燈玉露愈傷組織誘導再生體系及組培苗形態建成研究

楊玉珍，張耀武

(南陽農業職業學院植物組織培養中心，河南南陽 473000)

冰燈玉露為百合科十二卷屬中軟葉類多肉植物，原產于南非，植株低矮，葉片呈蓮座狀緊湊排列，葉色碧綠，葉片頂端具晶瑩剔透的透明窗，“窗”大而透亮，具有較高的觀賞價值，故名為“玉露”，是百合科具有代表性的花卉品種，具有良好的市場前景，受到園藝工作者和花卉愛好者的青睞。近年來，我國和日本園藝工作者將從海外引進的玉露品種通過篩選，選擇特征明顯的優秀良種，再經過不同品種間相互授粉、育苗、選種的過程培育出冰燈玉露、紫肌玉露等精品玉露，為保證這些精品玉露的優良性狀，通常采用葉插和底座繁殖等無性繁殖方式，這些繁殖方法易損害母本，然而玉露本身生長速度慢，繁殖系數小，繁殖速度極慢，難以滿足市場需求，導致其價格居高不下。近年來，采用組培快繁技術對多肉植物進行繁殖的研究較多，而由于常規育種一些新的性狀很難通過雜交的方法獲得，通過組織培養誘導愈傷組織建立遺傳轉化體系進行誘變育種、體細胞雜交、轉基因技術等種質變異研究，是培育新品種的重要途徑，因此, 獲得胚性愈傷組織是種質創新育種的關鍵。

通過組織培養技術繁殖的商品苗，在外觀形態上與分株或播種繁殖苗存在明顯差異，其中組培苗基部葉片細長畸形，觀賞效果差，將這些葉片去除后導致植株整體形態不完整，從而失去觀賞價值。這是由于瓶中移栽出的組培苗葉片細長，厚度不足，整體植株細弱，生長勢不強，有些組培苗不生根，即使生根也很細弱，且容易爛掉，導致組培苗需要數月乃至更長時間的馴化硬化階段，新生葉才能恢復其正常的品種特征，呈現出觀賞特征，這種情況不僅增加了培養時間，提高了生產成本，還影響了商品價值，從而使這一技術的應用受限。然而，探索在組培增殖階段和壯苗階段克服這項技術難題，目前在該領域鮮見報道。筆者以冰燈玉露葉片作為外植體，誘導產生松散的胚性愈傷組織，進行離體再生，研究不同激素組合、培養方式對誘導松散型愈傷組織、誘導不定芽建立再生體系及建成促進正常形態的影響，建立一套完整的組織培養植株再生體系，旨在為冰燈玉露遺傳變異、轉基因育種及快速繁育優良新種質提供技術支持。

1 材料與方法

供試材料為冰燈玉露。

外植體的選取和預處理。將冰燈玉露基部成熟葉片摘下，用洗滌劑溶液浸泡5 min左右，用軟毛刷仔細清洗，用自來水沖洗1 h。

外植體的滅菌與初代培養。在超凈工作臺上，將預處理的外植體葉片用75%乙醇溶液滅菌10 s，然后將0.1% HgC1溶液倒入燒杯中滅菌14 min ，再用無菌水沖洗5遍后，將葉片接種在不同初代培養基上。選取MS培養基為基本培養基，3%蔗糖，0.5%瓊脂，pH 5.6。以6-BA、2,4-D和NAA 3種激素的較低水平進行組合試驗，每處理10瓶。接種25 d后觀察愈傷組織誘導情況。培養條件：光照強度2 500 lx，光照時間12 h，溫度(23±1) ℃。

不定芽誘導培養。愈傷組織培養一段時間后，自葉片基部切下轉入不定芽誘導培養基中，選取6-BA和NAA進行不同濃度的組合配比試驗，以MS培養基為基本培養基。每處理20瓶，20 d后觀察不定芽誘導情況，篩選最佳增殖培養基。不定芽增殖到一定數量后，轉入叢生芽增殖培養基。

叢生芽增殖培養。當叢生芽長到1.5～2.5 cm，具3～4片葉時自底部切下，轉入生根增殖培養基上進行繼代增殖，每瓶接種5株小苗。選擇1/2MS為基本培養基，以不同濃度的NAA和NAA進行增殖培養試驗，附加0.3%活性炭，接種30 d后調查幼苗生長情況。

不同激素對冰燈玉露形態建成的影響。經過增殖培養獲得的冰燈玉露組培苗在移栽前形態與自然生長苗存在較大差異。為了在移栽前對組培苗進行形態重建，將組培苗轉移至含有不同激素的培養基上進行培養，以獲得生長外形與自然狀態下一致的幼苗。每瓶加入50 mL培養基，每處理20瓶，每瓶接種2個再生苗。培養條件:25 ℃,24 h連續光照，光照強度2 000 lx。接種后每天觀察再生苗的生長情況，經過約40 d培養，觀察再生苗在不同培養基上的形態變化情況。

不同光照強度對冰燈玉露形態建成的影響。冰燈玉露形態重建苗在煉苗移栽階段溫度和光照都會影響其性狀，通常在溫室溫度保持在20～28 ℃時進行煉苗移栽，這時光照強度對組培苗的形態影響較大。先帶瓶置于加蓋遮陽網的大棚中不開蓋進行過渡煉苗，7 d后逐步開蓋，清洗培養基，栽植到蛭石、小石子、草炭土、粗沙混合培養土上，防止強光照射。

對比煉苗階段不同光照強度對提高形態重建率的影響，采用4 000、3 000、2 500、2 000、1 500 lx的光照強度對冰燈玉露小苗進行煉苗硬化。

2 結果與分析

外植體葉片在愈傷組織誘導培養基上培養25 d后，觀察統計愈傷組織生長情況，結果見表1。由表1可知，使用低濃度6-BA和NAA組合愈傷組織誘導率低，愈傷組織較硬，不利于下一階段不定芽的誘導；添加2,4-D后誘導率較高，2,4-D濃度≥0.8 mg/L時，更有利于疏松愈傷組織的誘導，濃度越高，愈傷組織越疏松，顏色越淡，甚至出現玻璃化現象。通過圖1對比分析發現，添加低濃度6-BA有利于愈傷組織的形成，但濃度為1.0 mg/L時有部分不定芽萌出。綜合分析可知，冰燈玉露愈傷組織最佳誘導培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.8 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈傷組織分割后繼續培養能增殖出大量疏松的愈傷組織，是后期遺傳轉化研究和離體再生植株的最佳材料。

表1 愈傷組織誘導培養基激素配比

將誘導出的松散愈傷組織轉移到不同濃度組合的不定芽誘導培養基中，接種后20 d調查叢生芽誘導生長情況，結果見表2。由表2可知，6-BA濃度在1.0 mg/L以下對不定芽的誘導作用不明顯，添加IBA后對不定芽誘導也沒有明顯的促進作用，低濃度6-BA和較高濃度的NAA配比對叢生芽誘導生長有利，較高濃度的6-BA導致叢生芽分化率過高，細弱畸形，失去觀賞性。從圖2可以看出，配方6的生長情況最好，當6-BA濃度為0.6 mg/L，NAA為1.0 mg/L時，較有利于不定芽的分化，芽增殖倍數較高，苗健壯，葉色濃綠。因此，不定芽誘導最佳激素配比為配方6的6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L。叢生芽在誘導培養基中生長25 d左右，將叢生芽切分后轉入新鮮的增殖培養基中培養。繼續移入附加6-BA 0.6 mg/L +NAA 1.0 mg/L的培養基中進行增殖培養，增殖倍數達4.7，每25 d左右繼代1次。

表2 不同激素配比對誘導不定芽的影響

注：A為配方1葉片基部長出少量愈傷組織;B為配方3葉片基部長出較大愈傷組織;C為配方4葉片基部長出淡綠色愈傷組織; D為配方8愈傷組織分割后繼續培養有不定芽萌出，出現玻璃化現象；E為配方2愈傷組織顏色發黃、質地硬; F為配方4淡綠色愈傷組織分割后繼續生長 Note:A is formula 1, a small amount of callus grows from the leaf base; B is formula 3, the leaf base grows large callus;C is formula 4, with pale green callus on the leaf base; D is formula 8,after the callus was divided and continued to be cultured, adventitious buds sprouted and vitrification occurred; E is formula 2, callus color is yellowish and hard;F is formula 4, the light green callus continued to grow after segmentation圖1 成熟葉片誘導愈傷組織比較Fig.1 Comparison of callus induction from mature leaves

注：A為配方1誘導叢生芽生長情況; B為配方2叢生芽誘導生長情況;C～E為配方4～6叢生芽生長情況；F～H分別為配方7、6、8增殖階段苗25 d生長情況; I為配方6增殖階段苗40 d生長情況 Note: A is the growth of induced cluster buds in formula 1; B is the induced growth of cluster buds in formula 2; C-E are the growth of cluster buds in formula 4-6; F-H are the 25 days growth of seedlings in the proliferation stage of formula 7, 6 and 8,respectively; I is the 40 day growth of the multiplication stage seedlings in formula 6圖2 不同激素配比叢生芽生長情況Fig.2 Growth of cluster buds with different hormone ratios

在前期不定芽誘導階段控制增殖苗增速與培養時間，培養時間過長，增殖過多，密集苗后期形態受影響，因此培養時間掌握在25～40 d全部轉接完畢，然后單株分栽到形態建成壯苗階段培養基中，每瓶接種2株，個別大苗每瓶單株接種。每瓶培養基50 mL左右，以1/2MS培養基添加不同濃度和比例的NAA與IBA進行幼苗生根試驗，結果見表3。由表3可知，添加不同濃度、不同比例的NAA與IBA對冰燈玉露幼苗形態建成、生根壯苗具有顯著影響，單獨添加一種激素如NAA或IBA時，冰燈玉露組培苗基本是形態不正常苗，這種苗的葉片較自然條件下細長，向上生長，植株過高，且形狀與自然狀態下的苗不同，葉片分布不規則，葉片上端具有觀賞價值的“窗”不明顯。該研究早期多批次試栽組培苗，移栽后需要很長時間的硬化階段，重建自然形態，而且組培苗肥大的肉質根，導致植株生長緩慢，移栽時肥大根易脫落。組合后的生長素以IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最佳，利于組培苗的形態重建，葉片圓鈍，排列整齊(圖3)，外觀上與自然條件下一致。

表3 生長素種類和濃度對組培苗形態建成的影響

注： A～D為配方1、2、4、5的形態重建苗生長情況; E為配方6 形態重建苗生長情況; F為配方6形態重建苗從瓶中取出的生長情況 Note:A-D are to the growth of morphological reconstruction seedlings of formula 1, 2,4 and 5; E is the growth of morphological reconstruction seedlings in formula 6; F is the growth of the morphological reconstruction seedlings of formula 6 taken out of the bottle圖3 不同激素組合組培苗形態建成情況Fig. 3 Morphogenesis of different hormone combinations

從圖4可以看出，在不同光照強度條件下，組培苗在生長速度與形態上出現較大變化，煉苗過程中光照過強或過弱都會出現畸形苗。在光照強度為4 000 lx時葉片易失水，邊緣皺縮，在光照強度為2 500 lx時效果最好，組培苗葉色正常，形態飽滿，煉苗20 d后組培苗達到自然狀態。光照強度2 500 lx 以下時，形態開始變薄變長，向高處生長，觀賞價值低。因此，在煉苗硬化階段，需要根據天氣和遮陽網材料及時測定光照強度，調整措施，保證觀賞性狀最佳。

3 結論

該試驗研究了不同激素配比對冰燈玉露愈傷組織誘導、不定芽誘導、增殖比率和單株形態重建和煉苗硬化階段光照強度的影響，形成了一套完整的繁育體系，獲得了與自然條件下形態一致的組培苗，結果表明：不定芽誘導增殖和單株形態建成階段的激素配比決定了冰燈玉露組培苗硬化移栽前的植株形態，光照環境是造成組培苗煉苗畸形的主要因素。冰燈玉露愈傷組織誘導最佳培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.8 mg/L+NAA 1.0 mg/L，愈傷組織最佳分化不定芽培養基為MS+6-BA 0.6 mg/L+ NAA 1.0 mg/L，分化時間短且不定芽增殖倍數較高，為4.7;采用1/2MS+ IBA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為形態建成壯苗生根培養基，可以獲得生長形態正常(與品種特性相一致)的組培苗，按照該方案系統培養，冰燈玉露組培苗移栽到20～28 ℃溫室環境下時，選擇在光照強度為2 500 lx時，能夠在短期內恢復其自然生長蓮座狀的特性，葉片肥厚圓鈍，窗體透亮。

注：A～E分別為4 000、3 000、2 500、2 000、1 500 lx光照條件下組培苗生長情況 Note: A-E are the growth of tissue culture seedlings under 4 000,3 000,2 500,2 000,1 500 lx light,respectively圖4 不同光照強度對煉苗的影響Fig.4 Effects of different light intensity on seedling refining