西紅花莖腐病致病真菌的分離與鑒定

吳皆寧，桂思琦，曹佳佳，杜 雪，李俊博，李秀娟，開國銀，周 偉

（浙江中醫(yī)藥大學 藥學院，浙江 杭州 311402）

西紅花Crocus sativus為鳶尾科Iridaceae番紅花屬Crocus多年生草本植物，又稱藏紅花、番紅花，為新“浙八味”之一。西紅花柱頭是其主要藥用部分，具活血祛瘀、涼血解毒、解郁安神等功效[1]，西紅花花絲富含藏紅花素、藏紅花甙等成分，對心腦血管以及神經(jīng)性疾病都有較好的預防和治療效果[2-3]。西紅花是三倍體植物，只能夠通過球莖來繁種。生產(chǎn)上，種球芽過多會分散營養(yǎng)運輸，不利用單個種球膨大為成品種球。因此，種植前抹芽是西紅花種球田間復壯的常規(guī)操作。常年無性繁殖，產(chǎn)生的抹芽傷口使得病害入侵并逐年累積，病害高發(fā)年份部分產(chǎn)區(qū)的莖腐病發(fā)病率可達40%[4]，使得西紅花產(chǎn)量急劇降低，很大程度上制約了西紅花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前已知的藥用植物病害中，真菌性病害占比高達80%[5]，真菌性病害也是導致西紅花發(fā)生球莖腐爛的主要病害。張國輝等[6]從貴州西紅花莖腐病病害樣本中分離鑒定出尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum和炭疽菌Anthracnosesp.等2種真菌，證實西紅花球莖腐爛病由兩者共同感染所致。吳李芳[7]發(fā)現(xiàn)浙江西紅花莖腐病的致病真菌為尖孢鐮刀菌的ZJU-1菌株和茄病鐮刀菌F. solani的ZJU-2菌株。ZHANG等[8]采用組織分離法從浙江西紅花中分離鑒定得到離生青霉菌Penicillium solitum，認為這是一種新的能導致西紅花莖腐病的致病真菌。可見不同品種西紅花感染的致病真菌是不同的。‘番紅花1號’C. sativus‘Saffron No. 1’是目前西紅花在浙江省的主栽品種，具有一定的抗莖腐病抗性，對引起該品種球莖莖腐病的致病真菌的分離與鑒定工作報道不多。本研究以浙江建德產(chǎn)‘番紅花1號’球莖為材料，分離并鑒定引起其該品種莖腐病的病原菌，以期為完善西紅花莖腐病致病菌數(shù)據(jù)，也為西紅花莖腐病科學防控和特效殺菌劑的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

健康及具有典型球莖腐爛病病癥的西紅花‘番紅花1號’種球均采自浙江省建德市三都西紅花專業(yè)合作社同一區(qū)塊種植基地。離生青霉菌由浙江中醫(yī)藥大學藥學院分離并保存，已研究證實具有球莖腐爛致病性[8]。

1.2 病原真菌的分離與純化

采用組織分離法對西紅花球莖腐爛病的病原真菌進行分離。腐爛球莖去種皮，流水沖洗后用體積分數(shù)75%的乙醇消毒浸泡1 min，再用體積分數(shù)5%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，無菌水徹底沖洗后控干。無菌條件下切取球莖病健交界處組織塊約2 mm3，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)板中，25 ℃恒溫培養(yǎng)。待組織邊緣長出菌落后，挑取不同顏色或形態(tài)差異明顯的菌落接種于新鮮PDA培養(yǎng)板上，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d。采用梯度稀釋劃線法對菌落進行3輪純化，直至挑取的單菌落生長速度相近、邊緣清晰，即可初步判定該真菌已純化完全。純化的真菌菌株保存于新鮮PDA培養(yǎng)板上，4 ℃倒置保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原真菌致病性檢測

將分離純化得到的致病真菌回接至健康球莖和植株，驗證其致病性；以離生青霉菌為致病性檢測的陽性對照，無菌水為空白對照。

1.3.1 健康球莖回接 取健康球莖，依據(jù)1.2方法進行表面消毒，并用無菌解剖刀切出表面積約1 cm2的淺傷口。將已純化的致病真菌接種到PDA培養(yǎng)板上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，使用打孔器在致病真菌菌落邊沿打取直徑為1 cm的菌餅，接種至球莖傷口處，并將切開的球莖組織小塊放回原位。回接后的球莖25 ℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察并拍照記錄種球的生長狀況和病變特性。

1.3.2 健康植株回接 將已純化的致病真菌接種于PDA培養(yǎng)板，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，逐步稀釋配制成孢子密度為106個·mL-1的懸浮液。取健康球莖，依據(jù)1.2方法表面消毒后用無菌解剖刀沿球莖外圈劃細淺傷口，球莖種植于滅菌基質(zhì)中，并澆灌孢子懸浮液。置于20 ℃，8 h·d-1光照下培養(yǎng)，每7 d澆灌1次。培養(yǎng)至30 d時挖出種球，分別觀察拍照，并按病情分級標準將球莖進行分級，統(tǒng)計發(fā)病率。病情分級標準：0級，無病斑；1級(輕癥)，腐爛面積占整個球莖≤20%；2級(中癥)，20%＜腐爛面積＜40%；3級(重癥)，腐爛面積≥40%。發(fā)病率=(腐爛球莖個數(shù)/處理球莖個數(shù))×100%[9]。

各處理生物學重復3次，采用t檢驗法進行差異顯著性分析[10]。

1.4 病原真菌的形態(tài)學觀察

1.4.1 菌落形態(tài)觀察 將已純化完全的病原真菌接種于PDA培養(yǎng)板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，觀察并記錄菌落的生長形態(tài)、大小、邊緣、顏色、光澤、生長速度、質(zhì)地等基本特征。

1.4.2 分生孢子形態(tài)觀察 采用改良透明膠帶法[11]，粘取適量已分離純化的致病真菌菌絲，制片，光學顯微鏡下觀察并測定分生孢子形態(tài)大小、菌絲附著胞及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等顯微特征。

1.5 病原真菌的分子生物學鑒定

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[12]提取純化致病真菌總基因組DNA，用通用引物ITS1/ITS6、ITS4R、rPB2-5F、rPB2-7CR分別對真菌核糖體基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列、RNA聚合酶Ⅱ亞基(RPB2)序列進行PCR擴增[5,7]。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳法檢測，切膠回收后送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLAST相似性比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌的分離與致病性測定

與無腐爛癥狀的球莖相比(圖1A)，患球莖腐爛病的西紅花地上部分葉片逐漸枯黃，球莖腐爛嚴重(圖1B)。采用組織分離法從田間感病西紅花種球中分離純化獲得真菌115株。選取1株菌落表型相對一致且檢測頻率占主要優(yōu)勢的菌斑，經(jīng)3輪分離純化，獲得生長速率一致、邊際清晰的純化菌斑。由圖1C～E可見：該真菌菌液接種到帶有小傷口的健康種球上培養(yǎng)7 d，種球出現(xiàn)感病癥狀，其腐爛癥狀與離生青霉菌陽性回接的陽性對照相似，而無菌水處理的陰性對照未產(chǎn)生明顯癥狀。統(tǒng)計不同處理下的球莖腐爛率，由圖2可知：處理組球莖腐爛率高達97.3%，陽性對照為93.7%，均極顯著高于陰性對照(P＜0.01)。推測分離得到的真菌是引起西紅花球莖腐爛的主要病害之一。

圖 1 西紅花種球田間發(fā)病癥狀與球莖致病性檢測Figure 1 Field symptoms and pathogenicity examination of the corm in C. sativus

2.2 病原真菌的形態(tài)學鑒定

將純化后的病原真菌接種于PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d為淡黃色圓形菌落，周圍呈絨毛狀分布；5 d時菌落中間出現(xiàn)褐黑色的顆粒狀孢子；7 d時形成圓形褐黑色厚絨狀菌落，表面粗糙，外圍包裹環(huán)狀白色絨毛，中心為褐黑色顆粒狀，背面為淡黃色，顏色較淺(圖3A和3B)。光學顯微鏡下，該菌頂囊呈大球形，雙層小梗呈放射狀著生于頂囊表面，長度一致，較為整齊；分生孢子呈褐黑色球形或橢球形(圖3C)。就形態(tài)特征而言，該菌與曲霉屬Aspergillus黑曲霉A. niger高度相似，初步鑒定該菌為黑曲霉[5]。

圖 2 西紅花球莖致病真菌種球回接的發(fā)病率Figure 2 Statistics on the morbidity of corm after mother plant inoculated with pathogenic fungus in saffron

2.3 病原真菌的分子生物學鑒定

為進一步明確所分離所得到的真菌菌株，用通用引物對該真菌核糖體ITS和RPB2序列進行PCR擴增和電泳檢測(圖4)，對陽性菌落的PCR擴增產(chǎn)物進行測序。NCBI比對結(jié)果顯示：擴增獲得的RPB2和ITS擴增序列都與不同物種來源的黑曲霉同源性最高，達99.6%以上。此外，將從西紅花中擴增獲得的ITS序列分別與其他物種組織中分離到的黑曲霉、喬治亞青霉P. georgiense、臭曲霉A.foetidus以及曲霉屬菌株進行序列進化親緣關(guān)系分析，結(jié)果顯示(圖5)：擴增獲得的真菌ITS序列A.nigerZ2與其他物種組織中獲得的黑曲霉ITS序列聚在同一分支上；RPB2序列與黑曲霉親緣關(guān)系較近。基于以上結(jié)果，推測本研究從西紅花中分離純化的致病真菌為黑曲霉。

圖 3 西紅花莖腐病致病真菌培養(yǎng)7 d的形態(tài)特征Figure 3 Morphological characteristics of the pathogenic fungi of saffron stem rot after 7 days of culture

圖 4 西紅花病原真菌的PCR擴增Figure 4 Identification of pathogenic fungus A. niger in saffron by PCR amplification

圖 5 西紅花病原真菌的進化分析Figure 5 Evolutionary analysis of pathogenic fungus A. niger in saffron

2.4 西紅花致病真菌感病球莖再分離與植株致病性檢測

為進一步驗證黑曲霉對西紅花生長期間植株的致病特性，將分離純化的黑曲霉接種到生長期為1.5個月、生長勢較好、帶葉片的西紅花育苗箱中，每周1次用黑曲霉稀釋菌液澆灌。培養(yǎng)1個月后發(fā)現(xiàn)(圖6和圖7)：水澆灌陰性對照西紅花種球正常生長，僅有15.3%的輕癥和21.3%的中度腐爛癥狀，無重度腐爛種球。離生青霉菌澆灌陽性對照所有種球均無法正常生長， 其中輕癥、中癥和重癥比例分別為31.0%、50.3%和21.7%；測試組莖腐病發(fā)病率同樣為100%，其中輕癥比例為14.3%、中度腐爛種球為44.7%，重度腐爛種球為41.0%。進一步證實黑曲霉是引起該品種西紅花球莖腐爛的致病真菌之一。

圖 6 西紅花致病真菌黑曲霉植株感病驗證Figure 6 Verification of plant susceptibility to A. niger, a pathogenic fungus of saffron

圖 7 黑曲霉回接后西紅花球莖的病癥與發(fā)病率Figure 7 Morbidity and disease characteristics of corm after mother plant inoculated with A. Niger in saffron

3 討論與結(jié)論

本研究從浙江省建德市一西紅花種植基地患病西紅花球莖中分離純化得到1株病原真菌；形態(tài)學、分子生物學和致病性試驗鑒定可知：該菌為黑曲霉，是引起該基地西紅花球莖腐爛的致病真菌。

黑曲霉為半知菌亞門Deuteromycotina絲孢綱Hyphomycetes叢梗孢科Moniliaceae曲霉屬常見種，能引起植物落花或?qū)е露嘀麑嵏癄€[13]，抑制植物苗和根的生長[14]，產(chǎn)生果實采后病害[15]等。本研究分離得到的黑曲霉可在PDA培養(yǎng)基上快速生長，培養(yǎng)5 d的菌落呈圓形，淡黃色至黑色，與張倩[16]、暢引東等[17]報道的黑曲霉培養(yǎng)初期呈白色的結(jié)果存在差異，這可能是所用材料不同所致。光學顯微鏡下，從‘番紅花1號’中分離到的黑曲霉分生孢子呈球形，分生孢子梗壁光滑，頂囊較大，呈球形，產(chǎn)孢梗雙層，與黃勛娟等[18]觀察到的黑曲霉結(jié)構(gòu)相似。

黑曲霉菌是一種腐生性真菌，通常在有傷口或壞死的植物組織上定殖引起植物組織壞死或是腐爛。田間生產(chǎn)中常用種植前抹芽的方式對西紅花種球進行復壯，抹芽產(chǎn)生的傷口極有利于黑曲霉的感染。本研究采用橫斷面切割產(chǎn)生的傷口接種黑曲霉，證實黑曲霉極容易感染西紅花種球，種球腐爛病發(fā)生率顯著上升。因此，建議種球復壯生產(chǎn)上的抹芽操作最好放在種植前半個月，待傷口愈合后再種植，以減少黑曲霉感染的概率；或是用生防菌劑處理種球后再種植，以減少黑曲霉等腐生性真菌的感染[19]。

細菌、真菌、病毒等微生物都能引起西紅花病害，以真菌引起的病害最為常見，造成的經(jīng)濟損失也最為嚴重[20]。目前已報道從腐爛種球中分離獲得的西紅花致病真菌包括尖孢鐮刀菌、巴西曲霉A.brasiliensis[21-22]、桔青霉菌Penicillium citrinum[23]、鏈格孢菌Alternaria alternata[22]、離生青霉菌[8]、茄病鐮刀菌[7]、炭疽菌[6]、紅棕孔韌革菌Porostereumsp.[24]、齊整小核菌Sclerotium rolfsii[25]等。以上研究表明：導致西紅花球莖腐爛的致病真菌具有種屬多樣性。各種致病菌之間是否存在相互作用使球莖腐爛癥狀加劇以及侵染西紅花球莖的機制，還有待進一步研究。

此外，西紅花球莖核心致病真菌的分離與鑒定工作也能為球莖腐爛病生防菌劑的開發(fā)與精準防控應用提供科學依據(jù)。生防菌是存在于土壤或根系表面的微生物，抑制病原菌的作用機制復雜，如拮抗[26]、溶菌、營養(yǎng)和空間競爭[27]、提高植物抗性[28]、促進植物生長[29]、產(chǎn)生抗生素或刺激植物防御反應等都可一定程度抑制病原菌。生產(chǎn)上，生防菌可有效替代化學藥劑，降低西紅花的發(fā)病率，但對環(huán)境和寄主卻無顯著的損傷作用。目前以主要致病菌為功能驗證菌株，已成功鑒定的生防真菌包括假單胞菌Pseudomonas[30]、木霉菌Trichoderma[31]和芽孢桿菌Bacillus[32]等，通過離體和平板對峙等實驗中證實其在致病真菌的防控中起顯著的拮抗作用。因此，西紅花球莖核心致病真菌的分離與鑒定的工作將為特效生防菌劑的開發(fā)提供鑒定靶標，具有重要的理論和生產(chǎn)意義。