黃曲霉毒素B1高靈敏定性定量免疫層析檢測方法的建立

章 先，王繼璇，程高釧，李 可，張曉峰，孫孟嬌，程昌勇，宋厚輝

（1. 浙江大學 醫學院，浙江 杭州 310058；2. 浙江農林大學 動物科技學院/動物醫學院，浙江 杭州 311300；3. 浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 杭州 311202；4. 浙江大學 動物科技學院，浙江 杭州 310058）

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)主要是由黃曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉Aspergillus parasiticus產生的有毒次級代謝物，可通過污染食品和飼料進入食物鏈，嚴重威脅動物和人類健康[1]。目前，國內外已發現超20種AFs，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)毒性最強，危害最大，已被國際癌癥研究機構(IARC)列為Ⅰ類致癌物[2-4]。AFB1具有強烈的“致突變、致癌和致畸作用”和免疫毒性，過量攝入可破壞人和動物的肝臟組織，引發急性中毒，長期攝入則會引發各組織器官癌變[5-6]。建立快速、高靈敏的AFB1檢測方法對于保障食品安全具有重要意義。在AFB1檢測手段中，儀器法如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)等雖靈敏度高，準確性和重現性較好，但設備耗材昂貴且操作繁瑣，難以用于樣本的初篩和在基層使用[7-10]；相比儀器分析法，基于抗原抗體反應的免疫分析法因操作簡單、靈敏度高且特異性好，在真菌毒素檢測領域應用較廣，特別是免疫層析法，省時高效且無需借助復雜儀器，尤其適合大量樣本的現場篩查[11-16]。本研究基于免疫層析技術原理，采用金顆粒標記AFB1單克隆抗體，在競爭反應模式下，優化金顆粒尺寸、層析體系各組成材料及相關緩沖液配方，最終建立AFB1高靈敏定性定量免疫層析檢測法，通過肉眼直接對檢測結果定性判定，或借助便攜式信號讀取設備實現定量分析，以滿足對AFB1污染情況快速篩查的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料

牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)、N,N-二環已基碳二亞胺(DCC)、二甲基亞砜(DMSO)、各真菌毒素標準品購自Sigma公司；AFB1單克隆抗體(Anti-AFB1)、硝酸纖維素膜和玻璃纖維等免疫層析耗材購自奧唯生物；黃曲霉毒素B1商品化檢測試劑盒購自無錫景麒生物；其他試劑購自上海國藥；谷物樣本由浙江省檢驗檢疫科學技術研究院提供。

1.2 AFB1完全抗原的制備與鑒定

選取不同載體蛋白(BSA和OVA)制備AFB1完全抗原。步驟：AFB1標準品(2 mg)溶解于甲醇-吡啶溶液(體積比1∶1)，加入5 mg CMO震蕩至完全溶解，70 ℃下攪拌活化2 h；活化產物自然干燥后，加入1 mL蒸餾水并使用氫氧化鈉溶液(1 mol·L-1)調pH至8.0，為去除體系中未反應的AFB1，使用5 mL苯溶液抽提3次，pH調至3.0 (0.2 mol·L-1鹽酸)，產物經5 mL乙酸乙酯抽提3次后干燥得到AFB1肟化物AFB1O；所得AFB1O溶解于2 mL二甲基甲酰胺(DMF)，分別加入DCC (8.9 mg)和NHS(5.0 mg)室溫攪拌活化4 h；BSA (14.0 mg)或OVA (9.3 mg)溶解于1 mL碳酸氫鈉溶液(0.1 mol·L-1，pH 9.5)，將上一步所得的AFB1O活化產物緩慢滴加至載體蛋白溶液，室溫混勻反應2 h；反應結束后在磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.4)中4 ℃透析72 h，每12 h換液，產物即為AFB1完全抗原，經酶聯免疫檢測法(ELISA)鑒定后保存備用。

1.3 金顆粒的制備與鑒定

采用檸檬酸鈉還原法分別制備不同粒徑的金顆粒(20和40 nm)用于單克隆抗體的標記[17]。具體步驟：250 mL三角燒瓶(在濃硫酸-重鉻酸鉀溶液中浸泡并使用去離子水沖洗干凈)置于磁力攪拌加熱器，加入100 mL質量分數為0.01%氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入0.750或0.375 mL質量分數為2%的檸檬酸鈉溶液分別制備20和40 nm粒徑的金顆粒，攪拌加熱至混合液顏色至酒紅色，調低功率繼續加熱5 min，室溫自然冷卻后即得到金顆粒溶液，采用目測法和透射電鏡掃描鑒定后備用。

1.4 金顆粒標記單克隆抗體的制備

金顆粒標記抗體最佳pH和抗體標記最佳結合質量濃度參考文獻[18]。金顆粒標記抗體步驟：使用10 mmol·L-1Tris-HCL溶液(pH 7.4)稀釋單克隆抗體Anti-AFB1至最佳結合質量濃度，金顆粒溶液經0.2 mol·L-1碳酸鉀調節至抗體標記最佳pH；取50 mL已調節pH的金顆粒溶液，邊攪拌邊加入待標記抗體，室溫混勻30 min；反應結束后加入BSA溶液(終質量分數為1%)，混勻30 min后4 ℃ 2 000g離心30 min，棄沉淀；上清8 000g離心30 min，將所得沉淀重懸于10 mL 2 mmol·L-1含質量分數為1%BSA的硼酸鹽緩沖液(pH 7.4)，8 000g離心20 min去除未結合的抗體，重復2次；所得沉淀溶解于5 mL硼酸鹽緩沖液，4 ℃保存備用。

1.5 定性定量免疫層析檢測法原理

定性定量免疫層析檢測法如圖1所示。檢測線包被AFB1完全抗原，質控線包被山羊抗鼠二抗，金顆粒標記的Anti-AFB1固定于金標墊。滴加待檢樣品，經層析作用后，可通過肉眼觀察檢測線與質控線顏色差異進行定性判定或經便攜式信號讀取儀檢測線信號值進行定量分析。

圖 1 黃曲霉毒素B1定性定量免疫層析檢測法示意圖Figure 1 Schematic diagram of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for the detection of aflatoxin B1

1.6 定性定量免疫層析檢測體系的優化

免疫層析法檢測效果受多種參數影響，如標記抗體所用金顆粒粒徑、檢測線包被抗原類型、層析各組分材料品種(包括硝酸纖維素膜、金標抗體固定墊和樣品墊)和各組分材料前處理液的類型和濃度[19-21]。優化策略：采用不同粒徑金顆粒標記單克隆抗體，評價穩定性和敏感性，選取最優；對不同硝酸纖維素膜(Millipore 135、Millipore 180、Pall 170和Sartorius CN 140)、金標抗體固定墊(Ahlstrom 8964、Ahlstrom 6613、國產GF06和國產GF08)和樣品墊(國產SB08和SB06)層析效果進行比較；以金標抗體穩定性和檢測效果為標準，優化金標抗體保存液、抗原包被液、金標抗體固定墊和樣品墊前處理液的最佳配方與濃度；確定樣本萃取液稀釋倍數，在消除基質影響的同時，獲得最佳檢測靈敏度。上述各參數優化均參考文獻[22]進行。

1.7 定性定量免疫層析檢測方法的建立

優化處理后的樣品墊、金標固定墊、硝酸纖維素膜和吸水板按圖2所示粘貼于PVC底板，相鄰部分依次重疊，壓實并切割成條(寬0.5 cm)。取100 μL梯度質量濃度的AFB1標準液滴至加樣孔，15 min后判定檢測結果。

圖 2 免疫層析體系各組分組成結構示意圖Figure 2 Sketch map of the immunochromatographic system

1.8 樣本萃取與加標試驗

樣本萃取：取待檢樣本5 g置于250 mL三角燒瓶，分別加入1 g氯化鈉和25 mL甲醇-水溶液(體積比7∶3)，劇烈震蕩15 min，4 000g離心5 min后過濾，所得萃取液經超純水稀釋后待檢。樣本加標：陰性樣本烘干后研磨過篩，加入AFB1標準品溶液，充分混勻后，室溫過夜放置后待檢。

1.9 免疫層析檢測法穩定性試驗

采用37 ℃加速試驗判定穩定性[18]。組裝密封好的試紙條置于37 ℃恒溫箱，不同天數(7、15、30 d)后取出，對其檢測靈敏度進行評價，預測常溫儲存保存期。

1.10 免疫層析檢測法與LC-MS/MS比較試驗

采用免疫層析檢測法、商品化檢測試劑盒和LC-MS/MS平行檢測天然AFB1陽性樣本，并對檢測結果的一致性進行分析。

2 結果與分析

2.1 AFB1完全抗原的鑒定

采用AFB1單克隆抗體對AFB1-BSA/OVA進行ELISA鑒定，結果如圖3所示，完全抗原組D(450)與對照比值(BSA/OVA)遠大于2.1，表明制備成功，可用于免疫學方法的建立。

2.2 金顆粒的鑒定

制備的金顆粒溶液顏色澄清鮮艷，40 nm金顆粒溶液顏色較20 nm深，無顆粒沉淀(圖4A)，透射電鏡掃描結果顯示顆粒粒徑與預期相符，尺寸均勻(圖4B)，可用于后續抗體的標記。

圖 3 AFB1完全抗原AFB1-BSA和AFB1-OVA的ELISA鑒定Figure 3 Absorbance of the AFB1 conjugates by indirect ELISA using their specific monoclonal antibodies

圖 4 目測法(A)和透射電鏡(B)對金顆粒的鑒定Figure 4 Colloidal solution of 20 nm and 40 nm diameter gold nanoparticles by visualization by naked eye (A) and images from TEM (B)

2.3 定性定量免疫層析檢測法相關條件的確定

2.3.1 不同粒徑金顆粒標記單克隆抗體效果評價 40和20 nm金顆粒標記物層析效果相當，但4 ℃儲存時前者性質更穩定，可保存4周，因此綜合考慮靈敏度和穩定性，后續試驗將采用40 nm金顆粒進行單克隆抗體的標記。

2.3.2 檢測線包被抗原的選擇 包被AFB1-BSA時，檢測線顯色清晰且靈敏度更好，后續試驗將采用AFB1-BSA作為檢測線包被抗原。

2.3.3 層析各組分材料種類和處理液的確定 層析組分材料會影響層析靈敏度、時間和穩定性。對各組分材料進行篩選，硝酸纖維素膜的比較結果顯示：Sartorius CN 140相較于其他，流動性更佳且檢測線不易彌散，層析15 min后即可判定結果，背景值低，為最優，封閉液為含質量分數為0.5%吐溫20(Tween-20)、1%聚乙二醇2000 (PEG 2000)、2%BSA和0.01%疊氮鈉(NaN3)的10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，PBS)；金標抗體固定墊的比較結果顯示：Ahlstrom 8 964上固定的金標抗體可在15 min內釋放完全且無聚沉，為最優，處理液為含質量分數為4%蔗糖、1%BSA和0.25%表面活性劑TritonX-100的50 mmol·L-1硼酸鹽緩沖液(pH 7.4，BB)；樣品墊的比較結果顯示：國產SB08對含甲醇、纖維素和蛋白質的樣本承載能力和緩沖能力更強，為最優，前處理液種類與金標固定墊相同。

2.3.4 金標抗體儲存稀釋液以及抗原包被液的確定 對含不同質量濃度海藻糖、NaN3和OVA的10mmol·L-1硼酸鹽緩沖液(pH 7.4，BB)在4 ℃條件下對金標抗體的儲存和稀釋效果進行比較，結果顯示：在質量分數為10%海藻糖、1% BSA的條件下，金標抗體復溶效果較好且可穩定保存30 d，最終確定金標抗體存儲稀釋液為含質量分數為10%海藻糖、1%BSA和0.05%NaN3的10 mmol·L-1的硼酸鹽緩沖液(pH 7.4，BB)。抗原包被液優化結果顯示：含體積分數為3%甲醇的10 mol·L-1硼酸鹽緩沖液(pH 9.0，BB)可使檢測線顏色更加均勻和清晰。

2.3.5 金標抗體和包被抗原質量濃度的確定 為獲得最佳的檢測效果，對完全抗原包被質量濃度和金標抗體的使用質量濃度進行優化，最終確定AFB1-BSA的包被質量濃度為0.4 g·L-1，10倍稀釋后的金標AFB1單克隆抗體噴涂量為20 μL·cm-2。

2.4 定性定量免疫層析法的檢測限與特異性

2.4.1 定性定量免疫層析檢測法靈敏度的確定 如圖5所示：與對照相比，隨著AFB1質量濃度的升高，檢測線逐漸變淺直至消失，肉眼條件下，使檢測線質量濃度發生明顯變化的最低標準品質量濃度即為檢測限，因此，本免疫層析法的檢測限為0.10 μg·L-1。配制系列梯度質量濃度的AFB1標準品溶液進行檢測，層析結束后使用便攜式信號讀取儀分析檢測線信號強度。以標準品質量濃度(x)為橫坐標，檢測線信號強度抑制率(y)為縱坐標，繪制標準抑制曲線，進行線性回歸分析(圖6)，線性方程為y=0.631 9x+1.159 1，R2=0.984 3，定量區間為0.03～0.27 μg·L-1，檢測下限為0.02 μg·L-1。

圖 5 免疫層析法對黃曲霉毒素B1的定性檢測限Figure 5 Detection limits of immunochromatographic assay for aflatoxin B1

圖 6 免疫層析法對黃曲霉毒素B1的抑制曲線(A)和定量標準曲線(B)Figure 6 Tri-parametric curve fitting of log concentration of aflatoxin B1 vs inhibition rate by immunochromatographic assay (A) and the calibration curve for quantification of aflatoxin B1 (B)

2.4.2 定性定量免疫層析檢測法交叉反應性的確定 以谷物類樣本中其他常見真菌毒素如赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏馬毒素B1(FB1)和嘔吐毒素(DON)作為競爭抗原，進行特異性驗證，結果如圖7所示，建立的免疫層析檢測法對上述毒素均不存在交叉反應，特異性較好，質量濃度均為5.00 μg·L-1。

2.4.3 定性定量免疫層析檢測法對加標樣本的檢測 如圖8所示：對玉米Zea mays樣本進行加標試驗，當AFB1加標質量分數為2.5 μg·kg-1可使檢測線變化明顯，說明該免疫層析檢測法在實際樣本中的定性檢測限為2.5 μg·kg-1。

圖 7 定性定量免疫層析法對其他真菌毒素的交叉反應性Figure 7 Cross-reactivities of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for different mycotoxins

圖 8 免疫層析法對黃曲霉毒素B1加標樣本的定性檢測Figure 8 Qualitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography

當AFB1加標質量分數依次為1.0、2.5、5.0和15.0 μg·kg-1時，如表1所示，該免疫層析法在玉米樣本中的加標回收率為89.62%～110.43%，批內變異系數為4.51%～6.58%，批間變異系數為7.28%～9.72%，說明該方法準確率較高且穩定性較好。

2.5 定性定量免疫層析檢測法穩定性驗證

37 ℃加速穩定性實驗結果表明：建立的免疫層析試紙條放置30 d后仍能對AFB1進行定性檢測與定量分析，靈敏度未受影響，表明穩定性良好，推測室溫可穩定保存1 a。

表 1 免疫層析法對黃曲霉毒素B1加標樣本的定量檢測Table 1 Quantitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography assay

2.6 免疫層析檢測法與LC-MS/MS結果的比對

如表2和圖9所示：免疫層析法檢測結果與LC-MS/MS的相關性一致性較好(R2=0.863 1)，與商品化試劑盒的檢測結果經SPSS軟件分析，同樣顯示顯著相關(P＜0.01)。綜上表明：本研究建立的免疫層析檢測法可適用于實際樣本中AFB1的快速定量檢測與分析。

圖 9 免疫層析法與LC-MS/MS定量結果相關性分析Figure 9 Correlation of results obtained by immunochromatography assay and LC-MS/MS for AFB1 detection in natural samples

表 2 免疫層析法、商品化試劑盒和LC/MS/MS對天然樣本中黃曲霉毒素B1的定量檢測結果Table 2 Quantitative detection of AFB1 in natural samples by the developed immunochromatography assay, commercial ELISA kit and LC-MS/MS

3 結論與討論

常規免疫層析檢測法采用膠體金顆粒作為抗體標記物，通過在檢測線和質控線形成明顯的顏色反應，因此金顆粒粒徑對抗體標記效率和檢測靈敏度影響較大。本研究中，40 nm金顆粒標記AFB1單克隆抗體后，與20 nm相比，雖在檢測靈敏度上無明顯優勢，但穩定性更佳，故確定為最終的抗體標記物。作為免疫層析系統的重要組成部分，不同類型硝酸纖維素膜、金標抗體固定墊和樣品墊，會直接影響檢測效果[21]。本研究經對比，選用Sartorius CN 140、聚酯膜Ahlstrom 8964和玻璃纖維SB08分別作為硝酸纖維素膜、金標抗體固定墊和樣品墊使用。層析體系中各緩沖液的種類和質量濃度同樣影響檢測效果，如檢測線或質控線信號強度和清晰度、金標抗體釋放效率和穩定性以及樣本在硝酸纖維素膜上的遷移速率等[23-24]，并且適量質量分數蔗糖/海藻糖、BSA、PEG 2000、NaN3以及表面活性劑TritonX-100或Tween-20的加入有助于獲得更好的檢測效果和穩定性[23-26]。本研究制備的AFB1免疫層析檢測法在實際樣本中的定性和定量檢測限分別為2.5和0.5 μg·kg-1，滿足谷物及飼料中AFB1快速定性檢測和定量分析需求。相比ELISA，該定性定量免疫層析法更加簡單快速且成本低，適用于大量樣本的快速初篩，樣本結果疑似陽性再選用儀器法進行確認分析，可大大提升檢測效率。