AtJAR1基因在擬南芥耐鹽性中的功能分析

李丹丹，林 蓉，李新國，鄭月萍

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州311300；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東 濟(jì)南 250100）

近年來，全球氣候變暖，降雨量減少以及不適當(dāng)?shù)墓喔龋瑢?dǎo)致干旱以及半干旱地區(qū)土壤鹽漬化愈加嚴(yán)重，土壤鹽漬化成為全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中面臨的重大難題[1-2]。目前，中國可耕地面積中約1/5的鹽漬化土地，總面積高達(dá)0.98億hm2[2]。中國是世界人口大國，人均耕地面積不足0.1 hm2，如何利用鹽漬化的土地，促進(jìn)糧食產(chǎn)量的增加是艱巨的課題[3]，因此，研究植物的耐鹽性和生理機制，篩選及培育耐鹽作物品種成為農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域的熱點之一。

在長期的進(jìn)化過程中，植物進(jìn)化出多種應(yīng)對鹽脅迫的防御機制，其中報道較多的主要有4種：①滲透調(diào)節(jié)平衡機制。分為有機滲透調(diào)節(jié)和無機滲透調(diào)節(jié)。無機滲透調(diào)節(jié)是植物細(xì)胞通過吸收鈉離子(Na+)和鉀離子(K+)等無機離子作為滲透調(diào)節(jié)劑，將Na+在細(xì)胞內(nèi)區(qū)隔化，從而使根和地上部積累較多的Na+，但不會出現(xiàn)明顯的毒害癥狀[4-6]。有機滲透調(diào)節(jié)則是指植物通過自身合成并積累一些可溶性無毒的有機小分子物質(zhì)，如糖類、氨基酸類和甜菜堿等來維持細(xì)胞滲透平衡[7-8]。如鹽脅迫下，蘋果Malus pumila通過積累可溶性有機溶質(zhì)和無機鹽離子來降低胞內(nèi)滲透勢[9-10]，番茄Lycopersicon esculentum葉片中可溶性糖含量升高[11]。②離子的區(qū)域化與pH調(diào)節(jié)機制。植物細(xì)胞利用跨膜運輸將Na+和K+等無機離子轉(zhuǎn)運至液泡中，使之與細(xì)胞質(zhì)隔絕，降低滲透勢，避免細(xì)胞器遭受毒害[12]。同時，植物自身可以分泌有機酸從而調(diào)節(jié)根細(xì)胞中的pH穩(wěn)態(tài)，緩解鹽脅迫對根系的毒害[13]。③抗氧化防御系統(tǒng)機制。在高鹽脅迫下，植物細(xì)胞質(zhì)膜因受到水分脅迫或者離子脅迫而受損，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞內(nèi)積累大量的活性氧，當(dāng)積累的活性氧超過了細(xì)胞自身的清除能力就會對細(xì)胞造成損傷[8,14-15]。在長期的進(jìn)化過程中，植物自身會產(chǎn)生活性氧清除系統(tǒng)，包括一些抗氧化酶類等抗氧化物質(zhì)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)等，它們是衡量植物抗逆性的重要指標(biāo)[6,16-17]。④內(nèi)源激素和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)源激素在鹽脅迫反應(yīng)中起著重要作用，如脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)等[18-20]。同時，蛋白激酶途徑、ABA途徑(ABA依賴型、ABA不依賴型)、鹽超敏感(SOS)途徑等[21-24]信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也參與了植物對鹽脅迫的響應(yīng)，并在其中發(fā)揮重要作用。

植物激素信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是植物應(yīng)對各種非生物脅迫所必須的[25]。茉莉酸(jasmonic acid，JA)作為重要的植物逆境激素在調(diào)控植物耐鹽性方面發(fā)揮著重要的作用。耐鹽水稻Oryza sativa品種內(nèi)源茉莉酸含量高于鹽敏感品種，外源茉莉酸甲酯處理能夠提高水稻幼苗耐鹽性和大豆Glycine max幼苗對鹽脅迫的抗性[26-27]。鹽脅迫下，水稻JA信號調(diào)控基因OsJAZ9與OsbHLH062互作介導(dǎo)離子穩(wěn)態(tài)或通過增強抗氧化能力，從而增加對鹽脅迫的耐受性[28-29]；內(nèi)源茉莉酸通過維持番茄體內(nèi)活性氧穩(wěn)態(tài)來提高番茄的耐鹽性[30]。但是，目前關(guān)于JA信號如何調(diào)控植物的耐鹽性仍鮮有報道。茉莉酰氨基酸結(jié)合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1)催化JA形成JA-Ile，AtJAR1基因發(fā)生突變后可導(dǎo)致JA信號傳遞中斷。因此，本研究運用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建擬南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突變體，并考察突變體對鹽和ABA脅迫下的種子萌發(fā)和根系生長影響，以及鹽脅迫下突變體對K+的吸收轉(zhuǎn)運和AtHAK5表達(dá)量的影響，從而解析JA信號通路在植物耐鹽性中的可能生理機制。

1 材料與方法

1.1 AtJAR1基因突變體的構(gòu)建

1.1.1 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建及擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 CRISPR/Cas9靶序列的設(shè)計和載體的構(gòu)建參照WANG等[31]和朱麗穎等[32]的方法。以擬南芥茉莉酰氨基酸結(jié)合物合成酶AtJAR1為靶基因，選取鳥嘌呤和胞嘧啶含量高、特異性較強的2個關(guān)鍵片段作為靶序列，獲得雙靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體。以哥倫比亞野生型擬南芥為材料，使用農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens侵染法進(jìn)行擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化[33-34]。

1.1.2 突變體的篩選 CRISPR/Cas9編輯載體具有mCherry熒光蛋白報告基因，因此，本研究參考朱麗穎等[32]的方法，挑選T1代轉(zhuǎn)基因陽性種子，提取轉(zhuǎn)基因陽性植株的基因組DNA，在目標(biāo)基因靶序列2端設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴增(約200 bp)，利用質(zhì)量濃度8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE，丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的質(zhì)量比為29∶1)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測[32]。

1.2 地上部生物量測定

取播種后21 d的植株整個地上部，稱其鮮質(zhì)量。每個株系設(shè)置5個生物學(xué)重復(fù)，用單因素方差分析對株系間的差異顯著性進(jìn)行分析。

1.3 種子萌發(fā)試驗

1.3.1 種子消毒 1 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液清洗3 min，棄乙醇加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為35%的漂白水和體積分?jǐn)?shù)為0.05% 吐溫20混合溶液，輕輕搖晃混勻5 min，棄混合溶液；最后加入1 mL滅菌超純水，清洗5次，置于4 ℃避光春化2 d。

1.3.2 氯化鈉(NaCl)和脫落酸(ABA)培養(yǎng)基的配制 在1/2 MS植物培養(yǎng)基上添加不同濃度NaCl，分別配成0、75、100、125 mmol·L-1NaCl的1/2 MS植物培養(yǎng)基。將ABA溶于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中，配置成25 mmol·L-1的母液，參考STASWICK等[35]的濃度。用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇進(jìn)行稀釋，分別配成含0、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μmol·L-1ABA的1/2 MS植物培養(yǎng)基。

1.3.3 種子萌發(fā)率統(tǒng)計 將消毒后的種子均勻點在添加有不同濃度NaCl(0、75、100、125 mmol·L-1)和ABA (0、1、5、10、20 μmol·L-1)的1/2 MS植物培養(yǎng)基上，置于22 ℃、14 h光照/10 h黑暗的溫室中培養(yǎng)。隔24 h統(tǒng)計1次萌發(fā)率，連續(xù)6 d，以擬南芥胚根穿透種皮時即認(rèn)定萌發(fā)。每個濃度重復(fù)3次。萌發(fā)率=試驗時間(d)的萌發(fā)種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

1.4 幼苗耐鹽性和ABA耐受性分析

將消毒春化后的種子單粒點于1/2 MS植物豎直培養(yǎng)基上，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的條件下豎直培養(yǎng)5 d后，移栽在添加不同濃度NaCl(0、50、100 mmol·L-1)和ABA(0、0.25、0.50、1.00 μmol·L-1)的1/2 MS植物豎直培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，以根長來評估它們的生長狀況。

1.5 植物組織中K+和Na+質(zhì)量摩爾濃度的測定

1.5.1 幼苗培養(yǎng)及處理 將1/2 MS植物培養(yǎng)基上生長7 d幼苗，移栽至裝有1/5 Hoagland培養(yǎng)液的藍(lán)色花盆中(配方見表1)，培養(yǎng)14 d后對每個株系分別進(jìn)行鹽處理和對照處理。鹽處理更換外源添加50mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)液，在處理0和24 h時，分別取每個株系的根部樣品用于基因?qū)崟r表達(dá)量的檢測。處理2 d后，將每個株系的地上部和根部用去離子水潤洗后分別轉(zhuǎn)入做好標(biāo)記的信封中，放入恒溫60 ℃烘箱連續(xù)烘6 h以上進(jìn)行殺青。

1.5.2 樣品消解及稀酸溶液的制備 將待測樣品研磨后，稱取50 mg左右樣品用稱量紙送至潔凈干燥的消解管底部，每個樣本設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，依次加入7 mL濃硝酸、1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫水溶液，室溫放置2 h，最后放入微波消解儀消解。利用石墨趕酸儀于190 ℃下蒸發(fā)反應(yīng)液至2 mL左右。冷卻后將反應(yīng)液倒入離心管內(nèi)，用超純水將反應(yīng)液定容至15 mL。

1.5.3 消解液中鉀和鈉質(zhì)量摩爾濃度的測定 使用鉀和鈉的氯化物分別配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。離子的質(zhì)量濃度梯度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·L-1。利用原子吸收光譜法測定K+和Na+的質(zhì)量摩爾濃度。

1.5.4 植物組織中K+和Na+質(zhì)量摩爾濃度的計算 具體的計算公式如下：C= [(Cn-C′) × 0.015/(M×10-3)]/m。其中：C為1 g干物質(zhì)樣本中該離子的物質(zhì)的量(μmol·g-1)；Cn為各樣品消解液中該離子的質(zhì)量濃度(mg·L-1)；C′為空白對照消解液中該離子的質(zhì)量濃度(mg·L-1)；M為待測元素的相對分子量(g·mol-1)。m為樣品的干物質(zhì)質(zhì)量(g)。

1.6 相關(guān)基因的表達(dá)分析

采用Trizol法提取擬南芥根中總RNA，之后進(jìn)行基因組DNA的去除、反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測基因的相對表達(dá)量。從擬南芥信息資源庫中查找以編碼擬南芥肌動蛋白基因Actin2為內(nèi)參基因，根據(jù)已知的AtVSP1、AtVSP2和AtHAK5基因(Gene ID:AT5G24780、AT5G24770和AT4G13420)序列，設(shè)計qRT-PCR引物(表2)。采取2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達(dá)量。

表 1 1/5 Hoagland水培培養(yǎng)液配方Table 1 1/5 Hoagland formula for hydroponic culture solution

表 2 相關(guān)引物序列Table 2 Sequence of related primers

2 結(jié)果與分析

2.1 AtJAR1基因突變體的獲得及表型分析

2.1.1AtJAR1基因突變體基因型的分子鑒定 在早期的基因功能研究中，常采用反向遺傳學(xué)手段，構(gòu)建基因突變體。因技術(shù)水平的限制，前人構(gòu)建突變體的方法多為化學(xué)誘變法。然而，這種方式構(gòu)建的突變體多只在目標(biāo)基因發(fā)生點突變，使氨基酸殘基發(fā)生變化，基因功能未必完全喪失。例如，有研究發(fā)現(xiàn)：使用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變創(chuàng)建的ATS1基因突變體存在嚴(yán)重的基因滲透現(xiàn)象[36]。因此，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建AtJAR1功能完全喪失型突變體。經(jīng)多代篩選鑒定，從轉(zhuǎn)基因后代中獲得了2個純合突變體，分別將其命名為jar1-3-5和jar1-6-2。對其靶位點附近序列進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明：jar1-3-5和jar1-6-2突變體在第2個靶位點，即第3個外顯子處，分別發(fā)生了16和11 bp缺失的突變(圖1)，導(dǎo)致編碼序列(CDS)發(fā)生了相應(yīng)變化，氨基酸序列發(fā)生移碼突變。在轉(zhuǎn)錄后翻譯過程中，jar1-3-5的第111位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?I)，并在繼續(xù)錯誤翻譯12個氨基酸(SGTSQGRPKFIP-KAVQSLFLSLMN)后，引入終止密碼子UAA，提前終止翻譯；jar1-6-2的第113位氨基酸殘基由甘氨酸突變?yōu)榫彼幔⒃诶^續(xù)錯誤翻譯8個氨基酸(TSQGRPKF-PSKVYSFH)后，引入終止密碼子UGA，提前終止翻譯。因此，構(gòu)建的突變體可判斷為功能完全喪失型突變體。

圖 1 jar1-3-5和jar1-6-2突變序列信息Figure 1 Sequence information of jar1-3-5 and jar1-6-2 mutants

2.1.2AtJAR1基因突變體表型分析 將篩選的突變體(jar1-3-5和jar1-6-2)和野生型種子進(jìn)行播種，在生長前期觀察并比較兩者的表型差異。結(jié)果顯示：前21 d時，突變體植株可以正常生長，甚至其地上部明顯大于野生型。進(jìn)一步對生長21 d的植株地上部生物量進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：突變體極顯著(P＜0.001)高于野生型(圖2A)。之后，野生型和突變體之間的生長差異逐漸減小，并且在生長32 d時突變體植株葉片開始出現(xiàn)萎蔫的現(xiàn)象。

此外，AtJAR1可以催化JA形成JA-Ile，激活JA信號途徑，AtJAR1基因突變會影響植物體內(nèi)茉莉酸信號強度。因此，對茉莉酸信號標(biāo)記基因AtVSP1和AtVSP2進(jìn)行表達(dá)量分析顯示：AtJAR1突變后，AtVSP1和AtVSP2基因在根中的表達(dá)量極顯著(P＜0.000 1)減少，其中AtVSP1表達(dá)量下降了60%左右(圖2B)，AtVSP2表達(dá)量下降了80%左右(圖2C)。表明獲得的這2個突變體中茉莉酸信號強度明顯減弱。

圖 2 AtJAR1基因突變體與野生型的表型差異Figure 2 Phenotypic differences between AtJAR1 gene mutants and wild type

2.2 鹽脅迫對AtJAR1基因突變體的種子萌發(fā)率和幼苗建成的影響

2.2.1 鹽脅迫對AtJAR1基因突變體萌發(fā)率的影響 種子萌發(fā)是植株個體發(fā)育的重要階段。已有研究表明：鹽脅迫能夠抑制植物種子萌發(fā)，同時，JA作為重要的植物逆境激素在調(diào)控植物耐鹽性方面發(fā)揮著重要的作用[37-38]。然而JA信號通路在鹽脅迫下的種子萌發(fā)過程中發(fā)揮著何種作用尚不明確，因此，對鹽脅迫下野生型和突變體的種子萌發(fā)率(圖3)進(jìn)行統(tǒng)計分析可知：在不含NaCl的條件下，第1天突變體種子的萌發(fā)率極顯著(P＜0.01)高于野生型，第2天時各株系基本全部萌發(fā)，沒有顯著差別。在不同濃度NaCl處理時，雖然突變體和野生型最終都能達(dá)到或者接近于正常生長條件下的最大萌發(fā)率，但是達(dá)到最大萌發(fā)率的時間都隨著NaCl處理濃度的增加而有所推遲，且突變體均早于野生型；在處理的前3 d中突變體的萌發(fā)率雖隨著NaCl處理濃度的增加有所下降，但均高于野生型，并且隨著NaCl處理濃度的增加，這種差別逐漸顯著。表明AtJAR1突變加速了種子的萌發(fā)，降低了擬南芥在幼苗建成時對鹽的敏感性。

圖 3 不同鹽濃度下擬南芥種子的發(fā)芽率Figure 3 Germination rate of A. thaliana seeds under different salt concentrations

2.2.2 鹽脅迫對AtJAR1基因突變體根系生長的影響 幼苗建成是植株個體發(fā)育的另一個重要階段。一直以來鹽脅迫對幼苗的影響也是進(jìn)行抗逆研究的重要方向之一，因此，本研究比較了在鹽脅迫條件下野生型和突變體幼苗根的生長情況(圖4)。將在正常培養(yǎng)基上生長5日齡的幼苗轉(zhuǎn)移至含有不同濃度NaCl的豎直培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)在未用NaCl條件下，突變體的主根長與野生型相比無顯著差異。隨著NaCl濃度的增加，兩者的主根長度都隨之下降，但是，突變體的主根長度逐漸大于野生型，在100 mmol·L-1NaCl處理時，突變體的主根長顯著(P＜0.05)大于野生型，表明AtJAR1突變降低了擬南芥根對鹽的敏感性。

圖 4 鹽脅迫對jar1突變體主根長的影響Figure 4 Effect of salt stress on the main root length of jar1 mutant

2.3 ABA脅迫對AtJAR1基因突變體的種子萌發(fā)率和幼苗建成的影響

2.3.1 ABA對AtJAR1基因突變體萌發(fā)率的影響 ABA作為重要的植物激素，常與其他激素一起協(xié)同調(diào)控植物對逆境脅迫的應(yīng)答響應(yīng)，但是，目前并不明確JA信號途徑與ABA交互作用共同調(diào)控植物抗逆性的機制。本研究對jar1突變體在ABA脅迫下的種子萌發(fā)率進(jìn)行了統(tǒng)計(圖5)。結(jié)果表明：隨著ABA濃度的增加，野生型和突變體種子的萌發(fā)時間都相應(yīng)推遲，萌發(fā)率隨之下降，但是突變體的萌發(fā)時間均要早于野生型，萌發(fā)率也均顯著(P＜0.05)高于野生型，表明AtJAR1突變緩解了ABA對種子萌發(fā)的抑制作用。

圖 5 不同ABA濃度下擬南芥種子的萌發(fā)率Figure 5 Germination rate of A. thaliana seeds under different ABA concentrations

2.3.2 ABA對AtJAR1基因突變體根系生長的影響ABA脅迫下野生型和突變體幼苗根的生長情況見圖6。將正常培養(yǎng)基上的5日齡幼苗轉(zhuǎn)移到含有不同濃度ABA的豎直培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)：在未用ABA處理時突變體的主根長與野生型相比無顯著差異，但是，當(dāng)用各濃度ABA處理時，突變體的主根長均極顯著(P＜0.01)大于野生型，表明AtJAR1突變降低了擬南芥根對ABA的敏感性。

圖 6 ABA對jar1突變體主根長對的影響Figure 6 Effect of ABA on the main root length of jar1 mutant

2.4 AtJAR1基因突變體離子質(zhì)量摩爾濃度分析

鹽脅迫下Na+不斷的積累，導(dǎo)致細(xì)胞K+質(zhì)量摩爾濃度降低。為避免高鹽條件下植物細(xì)胞中離子紊亂，維持K+穩(wěn)定吸收，植物細(xì)胞胞漿中的代謝酶必須保持低Na+、高K+的濃度水平[39]，因此，細(xì)胞中K+/Na+是鹽脅迫下保證植物正常生長的關(guān)鍵。本研究利用原子吸收光譜法測定了正常和鹽脅迫條件下突變體和野生型根中的Na+、K+質(zhì)量摩爾濃度(圖7)，發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下，突變體根中的Na+、K+質(zhì)量摩爾濃度較野生型都有所下降，特別是jar1-6-2下降顯著，但是K+/Na+并沒有發(fā)生顯著變化。當(dāng)用50 mmol·L-1NaCl處理后，突變體根中的K+質(zhì)量摩爾濃度較未處理時提高約40%，且顯著(P＜0.05)高于相同濃度NaCl處理下的野生型。NaCl處理后野生型和突變體根中的Na+質(zhì)量摩爾濃度都急劇上升，但兩者并沒有顯著差別。相應(yīng)地，鹽處理后野生型和突變體的K+/Na+都急劇下降，并且突變體比野生型高11%以上。表明AtJAR1突變，可能增加了鹽脅迫下植物對K+的吸收和轉(zhuǎn)運，影響了植物體內(nèi)的鉀鈉平衡，從而增強了擬南芥的耐鹽性。

2.5 鹽脅迫下AtJAR1基因突變體中相關(guān)基因的表達(dá)量分析

在植物獲得K+與維持K+/Na+穩(wěn)定的過程中鉀轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮著重要作用，而KT/HAK/KUP轉(zhuǎn)運體是植物中最重要的K+轉(zhuǎn)運體家族之一，其中的HAK轉(zhuǎn)運體可能在維持鹽脅迫下的鉀鈉穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要的作用[39-42]。目前，擬南芥中，AtHAK5是研究最為廣泛和深入的高親和性K+吸收系統(tǒng)成員[43]，因此，本研究通過對鹽脅迫下jar1突變體中AtHAK5的表達(dá)量進(jìn)行分析，探究JA信號通路在植物耐鹽性中的調(diào)節(jié)機制。圖8顯示：在正常條件下野生型和突變體根中的AtHAK5表達(dá)量無顯著差異；而50 mmol·L-1NaCl處理24 h后，野生型AtHAK5表達(dá)量無顯著變化，而突變體中AtHAK5表達(dá)量上升3倍左右，極顯著(P＜0.01)高于野生型。表明鹽脅迫下，AtJAR1突變影響了植物體內(nèi)K+的吸收和轉(zhuǎn)運。

圖 7 野生型和AtJAR1基因突變體根K+和Na+變化Figure 7 Determination of element contents in wild-type and mutants of AtJAR1 gene

圖 8 鹽脅迫下野生型和突變體中AtHAK5基因的相對表達(dá)量Figure 8 Relative expression of AtHAK5 gene in wild-type and mutants under salt stress

3 討論

JA是植物生長發(fā)育和防御過程中的關(guān)鍵信號分子，JA合成后經(jīng)AtJAR1催化形成JA-Ile，JA-Ile介導(dǎo)F-box蛋白與COI1-JAZ蛋白相互作用，釋放MYC2和其他轉(zhuǎn)錄因子(TFs)從而誘導(dǎo)早期JA應(yīng)答基因的表達(dá)。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制的2個jar1突變體，其JA信號標(biāo)記基因AtVSP1和AtVSP2的表達(dá)量極顯著下降，說明AtJAR1基因功能喪失，從而影響了JA信號傳導(dǎo)通路。同時，創(chuàng)制的這2個jar1突變體植株還表現(xiàn)出前21 d地上部生物量極顯著大于野生型，之后這種差異逐漸減小并出現(xiàn)葉片萎蔫的表型，這在早期的研究中并未提及[34]。此外，研究發(fā)現(xiàn)：通過基因編輯手段使AtJAR1基因突變可以緩解ABA對種子萌發(fā)的抑制作用，而這與早期的研究結(jié)果正好相反[34]。出現(xiàn)這些表型的差異極有可能是由于早期研究中的突變體jar1-1是通過EMS誘變的方法獲得，其目的蛋白僅第101位的絲氨酸(Ser)殘基突變?yōu)楸奖彼?Phe)[44]。在這種突變體中，AtJAR1基因功能可能未完全喪失，而本研究通過基因編輯手段構(gòu)建的突變體發(fā)生了大片段基因序列的缺失，從而引起氨基酸序列發(fā)生移碼突變以及翻譯提前終止等情況，是基因功能完全喪失型突變體。因此，獲得的這2個jar1突變體將有助于徹底研究AtJAR1基因的功能。同時，本研究也為利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制基因功能完全喪失型突變體，從而為進(jìn)一步研究基因功能提供借鑒和參考。

植物對鹽脅迫的耐受性與植物激素有著密切關(guān)聯(lián)。JA作為一種植物內(nèi)源激素，一方面能夠參與根系的生長與再生、下胚軸的生長、種子萌發(fā)、氣孔的開閉等多種生長發(fā)育過程，另一方面可以激活植物的防御機制，以應(yīng)對鹽害、低溫、干旱和病蟲害等逆境脅迫造成的傷害[45]。其中，在茉莉酸調(diào)控植物應(yīng)對逆境脅迫的過程中，首先被位于細(xì)胞表面的受體所識別，合成JA-Ile，而JA-Ile又能與E3泛素連接酶SCFCOI1和26S蛋白酶體相互作用，加快JAZ蛋白降解，從而緩解了與JAZ相互作用的轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用。而這些轉(zhuǎn)錄因子又參與調(diào)控各種脅迫耐受性的生理輸出響應(yīng)[46-47]。所以，本研究運用基因編輯手段使AtJAR1基因功能喪失，JA-Ile的合成受阻，對鹽脅迫耐受性的生理輸出響應(yīng)受到影響，表現(xiàn)為鹽脅迫對種子萌發(fā)和根系生長的抑制作用有所緩解。此外，許多研究表明：在植物響應(yīng)鹽脅迫的過程中，JA和ABA存在交互作用，而與JAZ蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄因子MYC2是JA和ABA交互作用的關(guān)鍵點[38]。ABE等[48]和LORENZO等[49]研究指出：MYC2過表達(dá)和突變體植株分別表現(xiàn)出對ABA敏感性的增加和降低。ABE等[48]和IWASAKI等[50]則指出：MYC2可以促進(jìn)鹽脅迫和ABA脅迫響應(yīng)基因RD22的表達(dá)。因此，本研究中jar1突變體表現(xiàn)出對ABA敏感性的下降可能是由于MYC2激活受阻所導(dǎo)致的。

在鹽脅迫下，Na+會爭奪植物鉀通道上K+結(jié)合位點，促進(jìn)K+的外排，降低K+的吸收利用，植物表現(xiàn)出對高鹽脅迫的敏感現(xiàn)象[51]。本研究中，jar1突變體根系在鹽脅迫下K+質(zhì)量摩爾濃度顯著增加，K+/Na+較野生型有所提高，這可能就是突變體對鹽脅迫的敏感性下降的原因之一。在植物獲得K+與維持K+/Na+穩(wěn)定的過程中鉀轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮著重要作用，T-DNA插入突變體研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥中AtHAK5是HAK家族中主要的K+轉(zhuǎn)運體之一[52]。在鹽脅迫下jar1突變體中的AtHAK5表達(dá)量極顯著增加，表明AtJAR1突變可以促進(jìn)AtHAK5的表達(dá)，從而增加植株根系對K+的吸收，提高K+/Na+。此外，AtHAK5還被證實參與植物對鹽脅迫及ABA的響應(yīng)[51]，說明突變體中AtHAK5表達(dá)的變化可能是通過JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與ABA的交互作用實現(xiàn)的。

綜上所述，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建AtJAR1基因功能完全喪失型突變體不僅有助于完善對AtJAR1基因功能的認(rèn)識，同時為進(jìn)一步研究植物激素與植物鹽脅迫提供研究材料和研究基礎(chǔ)。此外，JA信號通路可能通過MYC2與ABA交互作用，影響下游HAK5的表達(dá)，從而改變植物根系對鉀的吸收，使K+/Na+發(fā)生變化，最終影響植物對鹽脅迫的耐受性。