極危植物九龍山榧的大小孢子發生和雌雄配子體發育研究

冉鈺岑，何 芳，劉菊蓮，鄭子洪，鄭偉成，胡江琴，金孝鋒

（1. 浙江農林大學 林業與生物技術學院 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室/浙江省森林芳香植物康養功能研究重點實驗室，浙江 杭州 311300；2. 杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 311121；3. 浙江九龍山國家級自然保護區 管理中心，浙江 遂昌 323300）

九龍山榧Torreya jiulongshanensis為紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya高大喬木，雌雄異株，僅分布于浙江中部和西南部，模式產地為遂昌九龍山，被列為浙江省極小種群保護植物，最近一次被評估為極危(CR)植物[1]。2021年頒布的《國家重點保護野生植物名錄》中，其被列為國家Ⅱ級保護植物(http://www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2021-09/09/content_5636409.htm)。目前，九龍山榧的種群數量極少，僅17株，其中模式產地僅1雌2雄共3株，每年結籽量很少，無幼樹和幼苗，更新困難，而且生境破壞嚴重，人為干擾程度大[2-4]。九龍山榧作為榧屬的古老孑遺植物，對研究古植物學和古地理學具有重要意義，其對于改良香榧T. grandis‘Merrillii’品質也可能具有很大的潛在價值[5]。

植物的有性生殖發育異常是瀕危的主要原因之一，珍稀瀕危植物或多或少存在生殖障礙[6-7]。研究發現：云南紅豆杉Taxus yunnanensis不僅生殖周期長，且在1個雌配子體上有多個頸卵器，但最終只有1個或者少數幾個頸卵器能得到精子，傳粉效率低及雌雄性生殖系統發育不同步是造成其瀕危的主要原因[8]；香果樹Emmenopterys henryi在胚發育過程中存在明顯胚后熟現象，致使種子萌發率低，更新困難[9]；羊角槭Acer yangjuechi在雌配子體發育過程中存在嚴重的生殖障礙，出現胚珠敗育、胚囊退化及珠心組織細胞死亡等現象，是其瀕危的重要原因[10]；崖柏Thuja sutchuenensis從大、小孢子葉球形成至種子成熟的整個發育過程中均存在敗育，而胚珠敗育及雌配子體游離核時期至幼胚發育期間的敗育是其生殖障礙的主要原因[11]。

自20世紀初以來，國內外學者先后對榧屬幾種植物生殖生物學開展了研究[12-14]。然而，關于九龍山榧生殖生物學的研究至今未見報道。本研究采用石蠟切片法，對九龍山榧大、小孢子的發生和雌、雄配子體的發育過程進行研究，并與紅豆杉科其他植物加以比較，旨在從生殖生物學角度探討九龍山榧的種子發育及結籽率低下是否與其大、小孢子的發生和雌、雄配子的發育異常有關，以期為九龍山榧保育措施的制定提供生殖生物學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

九龍山榧取自模式產地：麗水市遂昌縣王村口鎮西坑下村(28°20′01″N，118°55′22″E，海拔501 m)。以林緣僅有的1雌株和與雌株相近的1雄株為樣株。

1.2 試驗方法

2018年6月底至2019年4月初，在小孢子葉球(雄球花)的芽分化到散粉期間，對其外部形態發育過程進行觀測、拍照，并記錄發育的各個時間段和重要時間節點。2018年6月28日至2019年2月13日，隔3 d采1次；2019年2月中旬至2019年4月初散粉，每天采樣。每次取樣5個。

2018年11月12日至2019年11月30日，在大孢子葉球(雌球花)的芽分化到種子發育期間，對其外部形態發育過程進行觀測、拍照，記錄各個發育時間段和重要時間節點。2018年11月12日至2019年4月4日，隔6 d采1次；2019年4月5—30日，每天取樣。每次取樣5個。

2019年4月5—6日的散粉期間，用毛筆對吐露傳粉滴的胚珠進行人工授粉，授粉2 h后進行觀察，對仍有傳粉滴吐露的胚珠進行補粉，直到該大孢子葉球不再吐露傳粉滴。2019年5月1日至2019年11月30日，隔6 d對大孢子葉球進行采樣。每次采集3～5個。

采集的大、小孢子葉球浸泡固定于FAA溶液(體積分數為38%甲醛溶液∶冰醋酸∶體積分數為70%乙醇溶液=1∶1∶18，體積比)中，置于4 ℃冰箱中冷藏保存。采用常規石蠟切片法進行制片，切片厚度為5～7 μm[15]，用改良愛氏蘇木精染色[16]，中性樹膠封片，在Motic BA410E顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 大小孢子葉球的生長發育

2.1.1 小孢子葉球的生長發育 2018年6月29日，九龍山榧雄株的多數枝條葉腋處已經可見新生的混合芽，長為2.78～3.96 mm[(2.40±0.11) mm]，寬為1.18～1.58 mm[(1.38±0.14) mm]，混合芽著生于當年生枝條上，偶見于2年生枝條(圖1A)。2018年9月22日，幼嫩的小孢子葉球體積明顯變大，長為2.24～2.55 mm[(2.40±0.11) mm]，寬為1.18～1.58 mm[(1.36±0.16) mm]，外裹鱗片葉，深綠色，頂端扁而寬；營養芽的體積變化不大，頂端與莖端相似，保持較尖的圓錐形(圖1B)。此時，從外觀上很容易將小孢子葉球與營養芽區分出來。2018年10月12日，小孢子葉球呈圓錐形(圖1C)，外裹綠色鱗片葉，基部著生4枚苞片，2輪鱗片。小孢子葉球單生，長為2.78～3.96 mm[(3.37±0.47) mm]，寬為1.01～1.91 mm[(1.62±0.38) mm]，有一短軸，軸上螺旋狀緊密排列著30～40枚小孢子葉，小孢子葉背面常著生4個(稀為3或5個)小孢子囊。2019年2月26日，小孢子葉球中下部變圓，呈淺綠色，芽鱗逐漸張開，露出小孢子囊(圖1D)。2019年3月25日，小孢子葉球葉軸伸長，小孢子囊突破苞片、鱗片，逐漸伸到芽鱗外(圖1E)，緊密的小孢子葉變得松散，小孢子囊完全暴露在空氣中，開裂后花粉散出，此時小孢子葉球成熟(圖1F)。成熟的小孢子葉球呈長圓柱形，飽滿，小孢子葉逐漸變成黃綠色。

2019年4月4日，小孢子囊開始散粉，散粉時間持續4 d，時間較快。散粉前小孢子囊開裂，花粉散出，顏色呈黃色。同一小孢子葉球中，葉軸基部的小孢子囊散粉通常比葉軸上部的早開裂(圖1G)。散粉后，小孢子葉球迅速干縮(圖1H)。

2.1.2 大孢子葉球的生長發育 2018年11月12日，1年生枝條頂端存在普通芽和生殖芽，外觀難以區分(圖1I)。此時，生殖芽內部的苞葉葉腋出現珠被原基的隆起(圖2A)。此后珠被不斷生長，2019年3月25日，珠被生長至珠心上方，包被珠心(圖2B)。此時，大孢子葉球2個，成對生于葉腋，外觀呈圓錐形，長為0.38～0.49 mm[(0.47±0.12) mm]，寬為0.26～0.29 mm[(0.28±0.09) mm]，兩側微微隆起，外裹綠色鱗片狀葉，著生于1年生雌株枝條頂端。每一大孢子葉球的短軸上緊密排列著4枚兩兩交互對生的苞片和最基部1枚側生的苞片，具1個直立胚珠。2019年3月28日，在小孢子葉球即將散粉前，大孢子葉球逐漸從外包苞片和鱗片中突破，伸到芽鱗外，胚珠開始暴露在空氣中，為接收花粉做準備(圖1J)。2019年4月6日，假種皮開始露出(圖2C)。此時，大孢子葉球呈圓球形，長為1.48～2.12 mm[(1.86±0.24) mm]，寬為1.07～1.47 mm[(1.37±0.28) mm]。2019年4月4—7日為散粉期，胚珠的珠孔端吐露出傳粉滴，授粉后傳粉滴消失(圖1K)。2019年4月23日，假種皮的長度逐漸生長至珠被1/2處，可見明顯的珠孔和珠心上部的溶解腔(圖2D)。2019年4月30日，胚珠個體逐漸變大，外層的珠被和假種皮逐漸伸長，但還未完全包裹住胚珠的珠孔(圖1L)。2019年6月8—29日，成對的大孢子葉球僅1個發育，發育的假種皮長度逐漸超過珠被，突破鱗片，包裹住胚珠(圖1M和圖1N)，先端較尖。2019年8月29日，胚珠長度增大，深綠色，胚珠著生的枝條頂端出現新生的小孢子葉球(圖1O)。2019年9月22日，大孢子葉球呈卵球形，長為6.18～7.28 mm[(6.85±0.42) mm]，寬為3.15～3.50 mm[(3.32±0.11) mm]，胚珠底部變黃，假種皮先端變紅(圖1P)。

圖 1 大、小孢子葉球(雌、雄球花)的發育Figure 1 Development of microstrobilus and macrostrobilus (male and female strobili)

2.2 小孢子發生與雄配子體發育

2018年8月20日，小孢子葉原基表皮下方的孢原細胞已經分化形成次生造孢細胞。次生造孢細胞緊密相連，呈多邊形(圖3A)。2018年11月12日，外層的次生壁細胞開始分裂、分化，小孢子囊由外而內最終形成矩形的表皮層，呈橢圓形的小孢子囊內壁，呈不規則散狀排列的2層中層細胞，以及最內呈長條形的絨氈層(圖3B)。小孢子囊發育類型為基本型。2018年11月15日，造孢細胞分化形成小孢子母細胞，最初的小孢子母細胞由于體積較大、排列緊密，呈多邊形，胞質濃厚，細胞核大(圖3C)。2019年1月3日，在小孢子母細胞不斷形成時期，最外層的表皮細胞經垂周分裂后，垂周壁加厚，徑向壁延長，細胞內液泡化，細胞核和核仁逐漸消失，木質化加強，以適應內部小孢子母細胞數目的增加；內壁細胞徑向延長，并纖維化加厚；中層細胞被擠壓，切向壁延長呈扁平狀緊貼內壁；絨氈層細胞在小孢子母細胞時期最初呈長條形單核延長，發育后期細胞個體逐漸變大，細胞質變濃，并以單核或雙核形式存在(圖3D)。2019年2月2日，排列緊密的小孢子母細胞逐漸從胼胝質中解離，變成游離的小孢子母細胞，形狀從多邊形變為圓形(圖3E)。

2019年2月26日至3月6日為小孢子母細胞減數分裂期。小孢子母細胞經過第1次減數分裂，形成2個子核(圖3F)，2個子核之間不形成細胞壁直接進入減數分裂Ⅱ期，再次分裂之后形成四面體形、左右對稱形2種類型的四分體(圖3G)。小孢子囊壁和中層細胞開始解體，絨氈層細胞多為雙核，由絨氈層出現的位置判斷絨氈層細胞為周原質團細胞，絨氈層類型為變形絨氈層。小孢子囊內約7%絨氈層出現異常膨大，堆疊在一起(圖3H)。2019年3月12日，四分體中的4個小孢子之間開始形成各自的細胞壁(圖3I)。2019年3月16日，四分體開始解體，胼胝質壁消失，小孢子的細胞壁逐漸加厚，形成游離小孢子細胞(圖3J)，絨氈層部分細胞進入藥室內部(圖3K)。2019年3月19日為小孢子細胞單核靠邊期，表皮細胞木質化加強，內壁繼續解體，中層細胞僅留下殘跡，絨氈層仍以雙核或單核形式存在(圖3L)。一些小孢子囊內游離小孢子內液泡化導致細胞變形，約占11%(圖3M)。

2019年3月31日，單核靠邊的小孢子細胞壁開始逐漸增厚，細胞核經過有絲分裂形成2個核，細胞質也在2個核之間形成細胞板將2個核隔開，其中大的核為管核，小的核為生殖核。此時，成熟花粉粒形成(圖3N)。成熟花粉粒的直徑為30 μm，雙核，表面褶皺成不規則狀，無氣囊?；ǚ鄢墒炱跁r，小孢子囊內壁與中層細胞僅剩殘跡，絨氈層消失，表皮細胞完全木質化并且帶狀加厚(圖3O)。2019年4月4—7日，開始散粉時，小孢子囊囊基部囊壁沒有加厚的開裂口破裂，從開裂口散出(圖3P)。2019年5月30日，在胚珠上方花粉粒萌發成花粉管，伸入珠心組織1/3處，花粉管中可清晰看到管細胞、生殖細胞和不育細胞，生殖細胞比不育細胞稍大(圖3Q)。2019年6月24日，花粉管入侵至珠心1/2處，生殖核明顯增大，管核與不育核明顯變小，且即將消失(圖3R)。2019年7月27日，花粉管抵達雌配子體壁，此時管核和不育核已消失，位于花粉管先端的精原細胞已分裂成2個形狀相似、大小相同的精細胞。精細胞核大、細胞質濃，形狀為橢圓形或圓形(圖3S)。2019年11月29日，花粉管伸長至頸卵器上方，精細胞明顯增大，細胞質濃厚(圖3T)。九龍山榧小孢子及雄配子體發育進程見表1。

圖 2 大孢子發生和雌配子體發育(含受精作用)Figure 2 Megasporogenesis and female gametophyte development (including fertilization)

2.3 大孢子發生與雌配子體發育

2019年4月6日，在散粉期，珠心下方與珠被齊平的水平線上出現一團核大、質濃、呈多邊形的造孢細胞(圖2E)。①大孢子發生時期：2019年4月23日，造孢細胞分化，在近中央位置形成大孢子母細胞，并進行減數分裂Ⅰ，形成大孢子二分體，二分體再進行減數分裂Ⅱ(圖2F)，最終形成縱向直列的4個大孢子。2019年5月18日，合點端的大孢子不斷發育，最終形成功能性大孢子，近珠孔的3個大孢子逐漸退化(圖2G)。②游離核時期：2019年6月6日，合點端的功能大孢子繼續進行多次有絲分裂，形成多核的雌配子體，但不形成細胞壁，細胞核呈游離狀態，分布在雌配子體的細胞質中(圖2H)。游離核之間由染色質絲相連。③細胞化時期：2019年8月11日，當游離核分裂8次，形成256個游離核后，在連接游離核間原生質絲的基礎上，開始向心式形成細胞壁，最后整個雌配子體完全細胞化(圖2I)。④頸卵器時期：當雌配子體不斷發育到一定程度，近珠孔端的一些細胞開始逐漸膨大，形成頸卵器母細胞。2019年9月22日，頸卵器母細胞進行平周和垂周分裂，最終形成4個較小的頸細胞和1個較大的中央細胞(圖2J)。剛形成的頸細胞呈圓形，細胞核明顯，個體較周圍細胞小，中央細胞呈圓形，細胞核較大，周圍細胞質濃。中央細胞進行1次不均等分裂，形成卵核和腹溝核，腹溝核很快消失。由于此過程發生較快，因此未捕捉到正在退化的腹溝核。2019年9月30日，初形成的卵核位于頸卵器的近珠孔端，周圍有少量細胞質包圍，卵核下方有1個大液泡(圖2K)。2019年10月13日，卵核開始下沉，往頸卵器的中央開始移動，同時蛋白泡出現(圖2L)。2019年11月12日，受精前，成熟的頸卵器中蛋白泡消失，細胞質變濃，卵細胞發育成熟且位于中央，等待受精(圖2M)。九龍山榧的頸卵器為橢圓形，多數位于雌配子體的近珠孔端，同一胚珠中有2個頸卵器。頸卵器的周圍通常緊密排列著1層套細胞，套細胞的細胞核大、體積較小(圖2L～M)。本研究觀察到九龍山榧每個胚珠中只產生1個雌配子體，含2個單生型頸卵器，與香榧相同。九龍山榧的大孢子及雌配子體發育進程見表1。

圖 3 小孢子發生和雄配子體發育(含精子形成)Figure 3 Microsporogenesis and male gametophyte development (including spermatogenesis)

表 1 九龍山榧的有性生殖過程Table 1 Process of sexual reproduction in T. jiulongshanensis

2.4 精卵受精

九龍山榧的受精作用發生于2019年11月29日，從傳粉到受精約7個月，在花粉管中產生2個大小相似的精細胞(圖3T)，受精前其中一個精細胞進入頸卵器中與卵細胞結合，另一個則停留在花粉管中(圖2N)。在精細胞接觸卵細胞前，精細胞邊緣整齊，細胞核明顯，兩者接觸時，精細胞邊緣開始變得模糊，細胞質因變得蓬松而染色較淺(圖2O)。在精細胞和卵細胞逐漸融合的過程中，精細胞核區逐漸消失，細胞質相融(圖2P)。

3 討論

裸子植物小孢子母細胞發育節律主要分為4種類型[17-20]：①小孢子母細胞的減數分裂過程起始于初冬，進入休眠期停止減數分裂，在翌年春季解除休眠后完成后續發育，如側柏Platycladus orientalis。②翌年春天形成造孢細胞，再分化成小孢子母細胞，小孢子母細胞不經過休眠直接開始進行減數分裂，如穗花杉Amentotaxus argotaenia。③小孢子母細胞于當年年底前已經分化形成，經過翌年春季才開始后續的減數分裂過程，如歐洲赤松Pinus sylvestris。④小孢子母細胞進行減數分裂并形成游離小孢子再越冬，翌年春季繼續發育為成熟花粉，紅豆杉屬Taxus加拿大紅豆杉T. canadenesis、短葉紅豆杉T.brevifolia、南方紅豆杉T. wallichianavar.mairei和云南紅豆杉T. yunnanensis等屬此類型。九龍山榧與香榧小孢子母細胞的發育方式相同[21]，這種發育方式避免了其減數分裂過程受到寒冷冬季低溫影響，降低了減數分裂發生異常的風險。九龍山榧在減數分裂時期部分小孢子囊的絨氈層發生異常增生和膨大現象。陳祖鏗等[22]對穗花杉研究發現：絨氈層細胞發生異常膨大在裸子植物發育中為異?，F象，其結果會導致小孢子母細胞受到擠壓，在減數分裂過程中發生異常，最終引起花粉敗育。這也曾在太白紅杉Larix chinensis[23]的小孢子發育過程中有過報道。九龍山榧花粉囊中的絨氈層從小孢子母細胞時期一直持續存在到單核靠邊期，直到形成成熟花粉粒才完全降解。絨氈層的延遲降解可能會爭奪游離小孢子細胞發育所需的營養物質和空間。單核靠邊期時，少部分小孢子囊中出現小孢子細胞內液泡化現象，導致一些細胞形狀變化、破裂。但由于花粉粒能在雌花胚珠的珠心上方萌發出花粉管，且雄配子體的發育基本正常，說明花粉粒具備正常的生理活性和后期生殖功能，這與本研究對其花粉活力測定的結果一致。由此可見，小孢子的發生和雄配子體的發育均正常。

裸子植物的花粉萌發普遍遲緩且花粉管的生長非常緩慢[24]。穗花杉于5月底開始散粉，7月中下旬形成精子，歷時約2個月[25]；短葉紅豆杉于4月底萌發花粉管，6月初形成精子，歷時1個多月[26]；南方紅豆杉2月中下旬散粉，4月中旬體細胞迅速分裂形成2個精子，歷時約2個月[20]；香榧于4月下旬散粉，7月中下旬花粉管中體細胞核分裂出2個大小相等的精核，過程近3個月[27]。九龍山榧4月初散粉，4月底花粉才開始萌發出花粉管，7月底雌配子體上方產生2個精原細胞。因此，九龍山榧從傳粉到形成精子，整個過程歷時近4個月，發育周期均較紅豆杉科其他種更長。這可能是雄配子體在花粉管中發育緩慢以等待頸卵器中的卵細胞發育成熟以完成受精[20]。受精延遲現象在裸子植物中普遍存在。白豆杉Pseudotaxus chienii于4月17日傳粉，5月下旬陸續發生受精作用，兩者相隔1個多月[28]；穗花杉于5月25日至6月15日傳粉，7月20—29日受精，兩者相隔約2個月[22]；云南紅豆杉的受精作用發生于3月底至4月初，傳粉與受精相隔約4個月[8]；香榧于4月下旬授粉，9月上旬發生受精作用，從傳粉到受精間隔4～5個月[27]。在本研究中，九龍山榧于4月初開始傳粉，11月下旬發生受精作用，從傳粉到受精需要約7個月，晚于紅豆杉科已經報道的大多數植物。

植物有性生殖過程的任何一個環節出現障礙，都會造成生殖失敗，種子減少，更新困難從而致瀕[29]。九龍山榧小孢子葉球8月中旬開始發生，至2019年7月底才形成精子，歷時11個月余；大孢子葉球11月中上旬開始發生，至2019年11月底才進行受精作用，過程歷時12個月余，雌雄生殖系統發育的周期均較紅豆杉科以往報道的其他種更長。生殖過程歷時久、環節多，增加花粉敗育、胚珠死亡的概率[8]，且從傳粉到受精時間跨度大，加之個體數量極少，僅1雌株2雄株，胚珠發育嚴重滯后于小孢子葉球的散粉期，可能導致受精率降低甚至受精作用受阻。此外，陳佳妮等[30]發現：香榧結籽高于榧樹，在于前者成熟葉片的氮含量和光合能力顯著高于后者。九龍山榧為喜光的陽生樹種[31]，其結籽率低的原因可能還與雌株樹體老化、光合生理特性、外界營養不足等有關。

可見，九龍山榧冗長的生殖周期、復雜的生殖過程和雌性生殖系統發育明顯滯后于雄性生殖系統，加之人為干擾強、樹體老化、營養不足、個體數量少等均可能造成其結籽率底、自然更新困難，進而致瀕。從實際出發，對九龍山榧的保育可以借鑒香榧的培育技術：①由于九龍山榧雌雄異株，小種群中的花粉密度很難達到較高的水平，胚珠傳粉滴的吐露容易受不良天氣的影響，因此在散粉期收集足夠的花粉，將花粉合理優化保存，分期在晴天進行人工授粉以提高授粉率[32]；②加強雌株的科學管理，平衡施肥，追施磷、鉀復合肥[33]，淺根多次施肥，繁殖期葉面施淡肥[34]，從而促進胚的發育和提高坐果率。

4 致謝

材料采集過程中得到浙江遂昌王村口鎮西坑下村嚴東根先生的無私幫助。在此深表謝意！