基于網絡藥理學和分子對接技術探討黃精治療骨質疏松癥的作用機制*

邵一鳴，張濛，連鴻凱，張新安，何姣

1.鄭州大學附屬鄭州中心醫院，河南 鄭州 450001； 2.河南省人民醫院，河南 鄭州 450003；3.漯河市郾城區中醫院，河南 漯河 462300

骨質疏松癥(osteoporosis)是一種全身性代謝性骨病，其特征是骨量和韌性下降、骨微結構破壞以及骨脆性增加[1]。隨著人口老齡化的加劇，骨質疏松癥患者數量不斷增加。骨質疏松癥的嚴重后果為發生脆性骨折，從而導致殘疾率和死亡率增加[2]，盡早采取科學的預防策略和規范治療有著重要意義。目前，以促進骨形成和抑制骨吸收為特點的兩大類藥物被廣泛用于治療骨質疏松癥[3]，但同時也存在一系列副作用，包括中風、心血管疾病、胃腸不適及腎損傷等[4]。因此，期待能夠尋找到療效更加顯著、安全性更高的抗骨質疏松藥物為其臨床治療提供更多選擇。

長久以來，中藥一直被用于骨質疏松癥患者的補充和替代治療，在治療骨質疏松癥中起著不可估量的作用。黃精是百合科植物滇黃精、黃精和多花黃精的干燥根莖，味甘、平，無毒，具有補氣養陰、健脾潤肺、益腎等功效，可用于脾胃虛弱、體倦乏力、口干食少、肺虛燥咳、精血不足、內熱消渴等癥[5]。已有研究證明，黃精中的多糖類物質可以逆轉骨質流失并預防骨質疏松癥[6]。但是，由于中藥多成分、多靶點、多途徑的特點，其確切的作用機制有待探索。近年來，網絡藥理學的廣泛應用為研究人員提供了新的方向和策略來闡明中藥治療疾病的作用機制。基于此，本研究利用網絡藥理學方法探討黃精治療骨質疏松癥的有效成分、關鍵靶點和相關途徑，為今后骨質疏松癥的臨床治療和深入研究提供方向和思路。

1 材料與方法

1.1 黃精活性成分篩選及相關靶點獲取采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//tcmsp-e.com/)篩選黃精的活性成分。將藥代動力學參數作為中藥活性成分的篩選條件，設置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%及類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，篩選出藥物的活性成分，并提取藥物活性成分的相關靶點。

1.2 骨質疏松癥相關靶點的獲取使用GeneCards(https：//www.genecards.org/)數據庫和在線人類孟德爾遺傳(online mendelian inheritance in man，OMIM，https：//omim.org/)數據庫，以“osteoporosis”為關鍵詞進行檢索，得到骨質疏松癥的相關靶點。

1.3 黃精治療骨質疏松癥的潛在靶點的獲取使用在線軟件VENNY2.1(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對骨質疏松癥相關靶點和黃精活性成分相關靶點進行分析，取交集得到黃精治療骨質疏松癥的潛在作用靶點，并繪制韋恩圖。

1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建和核心靶點篩選將黃精治療骨質疏松癥的潛在作用靶點導入STRING在線數據庫(http：//string-db.org/)，設置置信度≥0.4，隱藏游離靶點，構建潛在靶點PPI網絡。將PPI網絡數據導入Cytoscape 3.8.2軟件進行拓撲分析，并利用Cytohubba插件根據網絡中節點的度值篩選核心靶點。

1.5 “黃精-活性成分-潛在靶點”網絡的構建為清晰呈現出黃精中有效成分與潛在靶點之間的對應關系，采用Cytoscape 3.8.2軟件構建“黃精-活性成分-潛在靶點”對應關系網絡，并進行拓撲分析，網絡中節點度值越大，表明該有效成分發揮的作用越大。

1.6 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號通路富集分析將潛在靶點提交至DAVID在線數據庫進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得到黃精治療骨質疏松癥的主要生物學功能和信號通路。

1.7 分子對接在Pubchem在線數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載節點度值靠前的有效成分的3D結構，從PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)下載PPI網絡中節點度值靠前的靶點的PDB格式文件，最后使用schrodinger軟件進行分子對接。

2 結果

2.1 黃精活性成分及相關靶點通過TCMSP數據庫檢索獲得黃精化學成分38個，根據OB≥30%及DL≥0.18篩選得到活性成分12個，剔除無對應靶點信息的3個活性成分，共獲得黃精活性成分9個及相關靶點86個。見表1。

表1 黃精活性成分信息表

2.2 骨質疏松癥疾病靶點及黃精治療骨質疏松癥的潛在靶點通過GeneCards數據庫篩選獲得骨質疏松癥相關靶點4 449個，OMIM數據庫獲得骨質疏松癥相關靶點136個，合并去重后共獲得疾病靶點4 490個。使用在線軟件VENNY2.1對骨質疏松癥相關靶點和黃精活性成分相關靶點進行映射，取交集后，獲得59個交集靶點，即為黃精治療骨質疏松癥的潛在作用靶點。見圖1。

圖1 黃精活性成分相關靶點與骨質疏松癥相關靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡及核心靶點將黃精治療骨質疏松癥的潛在作用靶點導入STRING在線數據庫構建潛在靶點PPI網絡。該PPI網絡包含59個蛋白質節點，488條邊。將PPI網絡數據導入Cytoscape 3.8.2軟件進行拓撲分析，并利用Cytohubba插件篩選出該網絡中節點度值排名前10位的核心靶點，分別是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase 1，AKT1)、腫瘤抗原p53(tumor protein p53，TP53)、轉錄因子AP-1(AP-1 transcription factor subunit，JUN)、絲裂原活化蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteme aspartate specific protease 3，CASP3)、雄激素受體(androgen receptor，AR)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)。采用STRING在線數據庫構建核心靶點PPI網絡。見圖2、圖3。

圖2 黃精治療骨質疏松癥的潛在靶點PPI網絡圖

注：節點大小和顏色與相互作用程度成正比圖3 黃精治療骨質疏松癥的核心靶點PPI網絡圖

2.4 “黃精-活性成分-潛在靶點”網絡圖采用 Cytoscape 3.8.2 軟件構建“黃精-活性成分-潛在靶點”網絡，圖中紅色節點代表黃精，藍色節點代表黃精的有效成分(隱藏游離靶點后，剔除沒有對應靶點的活性成分)，黑色節點代表黃精治療骨質疏松癥的潛在靶點。網絡拓撲分析發現，度值排名靠前的有效成分分別是黃芩素(節點度值為28)、β-谷甾醇(節點度值為23)。見圖4。

圖4 “黃精-活性成分-潛在靶點”網絡圖

2.5 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析通過DAVID 在線工具對潛在靶點進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。GO功能富集分析得到298個生物過程(biological process，BP)，31個細胞組分(cellular component，CC)及73個分子功能(molecular function，MF)，其中BP主要涉及葡萄糖輸入的正向調節(positive regulation of glucose import)、組織內細胞數量穩態(homeostasis of number of cells within a tissues)、對有機物的反應(response to organic substance)等；CC主要涉及樹突細胞質(dendrite cytoplasm)、細胞膜(membrane)、髓鞘(myelin sheath)等；MF主要涉及核因子-kappa B結合[(nuclear factor-kappa B，NF-κB)binding]、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、激活轉錄因子結合(activating transcription factor binding)等。將結果分別按照P值排序，使用微生信繪制出前10個結果的氣泡圖。見圖5。KEGG信號通路富集分析獲得85條信號通路，主要涉及癌癥相關通路(pathways in cancer)、細胞凋亡(apoptosis)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、破骨細胞分化(osteoclast differentiation)、雌激素信號通路(estrogen signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路[(tumor necrosis factor，TNF) signaling pathway]等。結果表明，黃精中多種有效成分可以通過多條不同信號通路作用于骨質疏松癥。選取P值前15的信號通路繪制氣泡圖。見圖6。

圖5 GO功能富集分析

2.6 分子對接結果配體與受體結合能量越低，其結合構象越穩定，相互作用的可能性越大。當結合能<-5.0 kcal·mol-1時，兩者具有良好的親和力。分子對接結果顯示，黃芩素和β-谷甾醇與關鍵靶點AKT1、TP53的結合能均<-5.0 kcal·mol-1，提示它們之間具有良好的結合力。見表2，圖7。

表2 黃精主要活性成分與關鍵靶點的結合能 (kcal·mol-1)

注：氣泡大小與通路中所含靶點基因數量成正比圖6 KEGG信號通路富集分析

注：A：黃芩素-AKT1；B：β-谷甾醇-AKT1；C：黃芩素-TP53；D：β-谷甾醇-TP53圖7 活性成分與核心靶點的分子對接模式圖

3 討論

數千年來，中藥一直以多成分、多靶點的方式用于預防和治療各種疾病，其在治療骨代謝相關疾病中更是處于舉足輕重的地位。黃精具有降血糖、 降血脂、抗腫瘤、抗骨質疏松、抗菌、抗病毒、增強免疫等多種藥理作用[7]。實驗證明，黃精中的黃精多糖可通過調控骨修復及骨代謝因子進而提高骨質疏松癥骨折大鼠生物力學性能及骨密度[8]。因此，本研究采用網絡藥理學和分子對接方法探索黃精的活性化合物及其治療骨質疏松癥的潛在分子機制。

基于TCMSP數據庫篩選得到黃精治療骨質疏松癥的有效化學成分包括黃芩素、β-谷甾醇、薯蕷皂苷元等。通過構建“黃精-活性成分-潛在靶點”網絡顯示，黃芩素可能在治療骨質疏松癥中發揮重要作用。黃芩素是一種黃酮類化合物，可阻斷NF-κB配體受體激活劑(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)通路誘導的信號分子從而抑制破骨細胞分化和成熟破骨細胞凋亡[9]。黃芩素還可通過MAPK/NF-κB/AP-1信號通路刺激成骨細胞分化[10]，通過激活NF-κB來觸發成骨細胞分化，進而誘導MAPK和NF-κB的激活來加速分化過程；在分化后期，黃芩素誘導MAPK和其他轉錄因子如AP-1和活化T細胞核因子蛋白c1 (nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的激活進一步誘導成骨分化。除此之外，黃芩素還可以通過抑制AKT促進叉頭框蛋白(forkhead box other 1，FOXO1)的表達從而改善糖皮質激素誘導的小鼠胚胎成骨細胞前體細胞成骨分化[11]。黃芩素具有成骨和破骨的雙向調節作用，在改善骨代謝平衡及治療骨質疏松癥方面具有廣泛應用前景。

通過PPI網絡分析，本研究得到黃精治療骨質疏松癥的核心靶點有AKT1、TP53、JUN、FOS、CASP3、MMP9、ESR1、MAPK14、PTGS2、AR等。AP-1 在骨骼系統中起到重要的作用，由FOS、JUN和激活轉錄因子(activating transcription factor，ATF)蛋白家族成員組成，與成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化和凋亡有著密切的關系[12-13]。研究發現，缺乏FOS、JUN的小鼠由于成骨細胞和破骨細胞缺陷導致骨量減少[14-15]。因此，FOS、JUN蛋白作為骨形成過程中的關鍵調節因子，可被用來開發作為治療低骨量疾病的藥物。AKT1是一種人類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調節包括新陳代謝、增殖、細胞存活和血管生成在內的許多生理過程[16]。同時，AKT1也是成骨細胞和破骨細胞分化和功能調節的因子，可以介導成骨細胞和破骨細胞前體之間的耦合[17]。AKT1還可以通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)通路被激活，PI3K-AKT信號通路是軟骨細胞、成骨細胞、成肌細胞和脂肪細胞等骨骼成分細胞分化的關鍵途徑[18]。體內外研究均表明，PI3K-AKT信號通路可以促進成骨細胞增殖、分化和骨形成抑制骨質疏松[19]。

在KEGG通路富集分析中，細胞凋亡信號通路、破骨細胞分化信號通路、p53信號通路、雌激素信號通路、TNF信號通路是黃精活性成分治療骨質疏松癥的重要信號通路。成骨細胞和破骨細胞來源于骨髓原始多能干細胞，分別在骨形成和骨吸收中發揮重要作用[20-21]。骨形成和骨吸收之間的平衡可以維持骨重塑和骨量。此外，骨微環境中的各種細胞因子作用于成骨細胞和破骨細胞的調節，促進骨重塑[22]。TNF-α由T淋巴細胞產生，通過抑制成骨細胞中堿性磷酸酶在抑制骨形成和礦化中起著至關重要的作用[23]。TNF-α可以刺激破骨細胞前體的形成并促進RANKL表達，從而影響骨吸收[24]，還可通過MAPK信號通路抑制成骨細胞分化[25]。這些證據都表明TNF-α抑制劑可能是有效預防或逆轉骨丟失的潛在治療靶點。p53由腫瘤抑制基因TP53編碼，通過減緩細胞生長和分裂來抑制腫瘤生長[26]。研究發現，骨質疏松癥患者血清p53水平升高并通過miRNA信號通路影響MSCs的功能來抑制成骨，敲低 p53 可部分逆轉骨密度降低[27-28]。雌激素是骨代謝的重要調節劑，通過骨襯細胞中RANKL的靶向表達控制骨轉換[29]。研究表明，OVX大鼠模型中雌激素缺乏會增加皮質骨的血管孔隙率，減少骨體積分數和小梁數量，并增強脛骨近端的骨小梁分離，降低骨強度[30]。值得一提的是，本研究所得到的靶點基因和信號通路相互驗證，環環相扣，進一步說明黃精的活性成分可能通過增強成骨細胞分化和骨形成同時限制破骨細胞發育和骨吸收治療骨質疏松癥。

分子對接結果顯示，黃芩素、β-谷甾醇與AKT1、TP53的對接結合力均<-5 kcal·mol-1，說明黃精活性成分與骨質疏松癥相關靶點能夠產生較好的蛋白結合活性。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學方法較為全面地分析了黃精治療骨質疏松癥的作用機制發現，黃精作用于骨質疏松癥的方式是多通路、多靶點及多有效成分的，為今后的研究提供了參考和數據支持，但該研究結果還需要進一步的實驗研究加以驗證。