小鼠膽囊膽固醇結石模型不同建立方法的研究*

謝玉春，閔莉

福建中醫藥大學，福建 福州 350122

膽囊膽固醇結石是臨床常見病和高發病，多發于女性、肥胖及中老年人群。飲食不規律、偏嗜高油高脂飲食等是目前我國膽囊膽固醇結石呈高發病率的主要原因[1-2]。常見的建立膽固醇結石動物模型方法包括控制動物飲食成分、縮窄及梗阻動物膽道、異物植入膽囊等[3]。研究發現，長期高脂致石飲食喂養可導致動物出現高血脂、肝臟脂肪性變、膽汁膽固醇過飽和，最終出現膽囊膽固醇結石，該方法成石率高、安全可靠，且表現的病理生理學變化與膽囊膽固醇結石患者相似[4]，是制備膽囊膽固醇結石動物模型的常用方法。膽囊膽固醇結石與肝膽系統結構功能異常、脂代謝失衡和免疫功能障礙等病理變化相關，制備可靠、高效的膽囊膽固醇結石模型是研究防治膽囊膽固醇結石的基礎，意義重大[5]。高脂致石飲食可成功制備疾病模型，但不同致石飼料的選用會影響模型建立的周期與效果。本研究通過對比相同喂養周期下不同飼料喂養誘導小鼠膽囊膽固醇結石模型的效果，探討制備高效、可靠膽囊膽固醇結石動物模型的方法。

1 材料

1.1 實驗動物36只5周齡SPF級ICR雄性小鼠，體質量(18±2) g，由福建中醫藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK(滬)2017-0005。所有小鼠飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級屏障系統，室溫(20±2) ℃，濕度50%～55%，12 h周期性光照環境，經普通顆粒飼料適應性喂養1周，無不良反應且飲食、飲水正常者納入實驗。本實驗經福建中醫藥大學倫理委員會審批通過，倫理批號：FJTCM IACUC2021067。

1.2 藥物與試劑小鼠總膽固醇(total cholesterol，TC)、總膽汁酸(total bile acids，TBA)、磷脂(phospholipid，PL)、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)ELISA試劑盒(江蘇酶免實業有限公司，貨號：MM-0632M2、MM-44537M2、MM-1001M2、MM-0028M1)。

1.3 儀器EG1150H型生物組織包埋機、RM2245型石蠟切片機(德國Leica公司)；SB80型攤片機、SW85型烤片機(德國Microm公司)；SZ66型體視顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司)；Axio Imager A2型顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備將36只5周齡SPF級ICR雄性小鼠隨機分為對照組、2%高脂組、1%膽固醇組，每組12只。對照組采用普通顆粒飼料(60%碳水化合物、22%蛋白質、10%脂肪、8%纖維)喂養；2%高脂組采用2%高脂飼料(每1 kg含全價飼料粉料825 g，膽固醇20 g，膽酸5 g，牛油150 g)喂養[6-7]；1%膽固醇組采用1%膽固醇致石飼料(0.5%膽酸鹽、1%膽固醇、56%碳水化合物、10%乳脂、18%蛋白質)喂養[8]，自由攝食16周后，通過查看小鼠膽囊結石的大小和數量、膽囊體積、膽汁渾濁度及透光性等評估模型。

2.2 小鼠存活率、成石率及結石形成情況觀察飼養過程中動態觀察小鼠精神狀態、飲食及飲水情況，記錄各組小鼠的死亡數量，計算存活率。小鼠處死后，觀察并記錄各組造模成功的小鼠數量及膽囊體積大小、膽汁的渾濁度、透光性等。

2.3 肝臟、膽囊HE染色喂養16周后，小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射麻醉后摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，打開腹腔，完整剝離膽囊并清理表面血液，體視鏡拍照后將膽汁吸取放入EP管保存備用，膽囊組織放入固定液中保存。在肝大葉處取一塊大小約為5 mm×5 mm的肝組織放入40 ng·L-1多聚甲醛固定，脫水、透明、包埋、切片、染色、封片后在顯微鏡下觀察膽囊、肝臟組織的形態變化。

2.4 膽汁中TC、TBA、PL、CCK的測定嚴格根據ELISA試劑盒說明書的要求進行操作，檢測膽囊中膽汁相關成分的含量。

3 結果

3.1 各組小鼠存活率、成石率及膽汁情況比較對照組小鼠無死亡，膽囊大小正常，膽汁澄清透亮，透光性好，膽囊內無沉淀。2%高脂組小鼠死亡1只，膽汁呈渾濁狀態，透光性變差，8只小鼠膽囊可見固體沉淀，成石率為67%。1%膽固醇組小鼠死亡1只，膽囊體積明顯增大，膽汁呈褐色渾濁狀態，透光性差，有10只小鼠膽囊出現明顯的固體沉淀，成石率約為83%。見表1、圖1。

表1 各組小鼠存活率、成石率比較 只

圖1 各組小鼠膽囊結石情況

3.2 各組小鼠膽囊膽汁脂類成分含量及CCK水平比較與對照組比較，2%高脂組和1%膽固醇組膽汁內TC含量升高，膽汁TBA、PL、CCK含量降低；與2%高脂組比較，1%膽固醇組膽汁TC、CCK含量降低，膽汁內TB、PL含量升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。2%高脂組和1%膽固醇組膽汁中TC、TBA、PL三者比例失衡，膽汁內膽固醇溶解率低，膽汁具有成石趨勢。見表2。

表2 各組小鼠膽囊膽汁脂類成分含量及CCK水平比較

3.3 各組小鼠肝臟、膽囊病理學改變肝臟HE染色顯示，對照組肝臟細胞排列整齊，結構完整；2%高脂組小鼠肝臟細胞結構破壞嚴重，可見大量脂質空泡，肝臟存在明顯的脂肪變性；1%膽固醇組肝細胞排列紊亂，細胞結構破壞，肝臟出現小的脂質空泡。膽囊HE染色顯示，對照組膽囊壁結構正常；2%高脂組膽囊壁肌層變厚，漿膜結構及形態破壞；1%膽固醇組膽囊壁肌層毛糙、增厚，漿膜結構及形態破壞嚴重。見圖2、圖3。

圖2 各組小鼠肝臟病理組織圖(HE，×150)

圖3 各組小鼠膽囊病理組織圖(HE，×200)

4 討論

膽囊膽固醇結石的發病涉及一系列復雜病理變化，年齡、性別、飲食習慣等相關危險因素[9]通過影響脂質代謝[10]、膽囊功能運動[11]致使膽汁化學成分異常[12]、膽汁淤積、細菌感染等誘發膽囊膽固醇結石。膽固醇為膽囊膽固醇結石的主要成分，膽汁膽固醇過飽和是膽固醇結石形成的首要條件[13]。正常膽汁中含有膽固醇、膽汁酸、磷脂三種脂類[14-16]。肝臟調控機體膽固醇的合成、分解、吸收與轉運，膽汁中膽固醇來源于肝細胞攝取的血漿脂蛋白膽固醇和肝細胞合成的膽固醇[17]。膽酸循環是清除類固醇物質的主要途徑，膽汁內膽固醇溶于膽鹽形成的微膠粒中，肝細胞內膽固醇異常代謝引起膽汁酸、磷脂等三種脂類比例失調是膽囊膽固醇結石重要的病理基礎[18]。本實驗結果表明，與對照組相比，2%高脂和1%膽固醇飲食喂養的兩組小鼠肝臟可見脂質空泡，膽汁TC水平升高，而TBA及PL水平下降，膽囊內膽汁渾濁，透光性差，且可見固體沉淀。膽固醇的攝入導致肝臟分泌到膽汁的膽固醇過多，產生的膽汁酸和磷脂過少，膽汁內脂類比例失調，膽汁膽固醇含量增高，過多膽固醇附著在膽囊黏膜表面最終形成膽囊膽固醇結石，即含膽固醇飲食誘導膽囊膽固醇結石模型的方法可靠。

研究表明，膽汁中的膽固醇飽和狀態不是形成膽固醇結石的唯一條件[19]，膽囊動力損傷可加速過飽和膽固醇結晶析出成石過程。膽囊膽固醇結石產生于膽囊，膽囊規律性的收縮和舒張運動促進膽汁的排出，可防止膽結石的發生。CCK介導膽囊收縮及胰酶分泌[20]，是調節膽囊運動最主要的激素，可評估膽囊功能[21]。動物模型和臨床研究提示，膽囊壁CCK受體在膽石癥膽囊收縮損害中起重要作用[22]。膽囊結石患者血漿CCK水平明顯降低[23]，血液循環中CCK與膽囊壁CCK受體結合可觸發膽囊收縮，將膽汁釋放到十二指腸，因此，CCK水平可間接反映膽囊壁CCK受體活性。本實驗研究結果顯示，與2%高脂組相比，1%膽固醇組CCK水平明顯降低，膽囊體積明顯增大，膽囊內有較大的固體沉淀，膽汁褐色渾濁，透光性差，膽囊壁毛糙、增厚嚴重。1%膽固醇組小鼠低水平CCK含量導致膽囊壁CCK與受體結合減弱，膽囊動力不足致使膽汁淤積于膽囊，膽囊體積增大；膽汁過度濃縮致使膽汁內成分發生改變，膽汁呈褐色渾濁狀態。CCK水平差異及膽囊結構病理變化導致膽囊動力減弱，為成石膽汁中過飽和的膽固醇成核、析出提供充足的時間和空間。

綜上所述，膽固醇飲食是建立膽囊膽固醇結石動物模型的重要因素，長期喂養含膽固醇致石飼料可導致肝臟脂肪性變，膽汁內三種脂類比例失調，膽固醇成核析出。但膽固醇對膽石癥的貢獻度受脂質代謝的內在差異影響[24]，致石飼料中膽固醇含量的高低并不是影響模型效果的唯一或者決定性條件。膽囊膽固醇結石是多因素共同作用的結果，1%膽固醇組與2%高脂組模型成功建立與攝入含膽固醇飲食導致機體脂質代謝異常有關，而兩組的模型效果差異可能與兩組CCK水平及膽囊形態結構差異影響的膽囊動力密切相關。2%高膽固醇飼料為課題組前期構建膽石癥“病”模型主要方法，本實驗通過對比1%膽固醇飼料與2%高膽固醇飼料喂養建立模型的差異發現，同一條件下，1%膽固醇飼料制備膽石癥模型效果優于2%高膽固醇飼料，即1%膽固醇飼料可作為制備膽囊膽固醇結石模型的備選，為課題組后期探討中醫藥防治膽石癥分子機制研究及其他相關研究提供模型支持。不同成分配比的致石飲食構建的模型效果存在差異，本研究僅對比了兩種致石飼料的模型差異，研究范圍較局限，對構建模型方法的選用有一定的參考價值，但未篩選出最優的造模方法。1%膽固醇組與2%高脂組CCK水平及膽囊形態改變與“病”模型差異具有一致性，但本研究未進行膽囊收縮功能相關實驗進一步證明模型差異與膽囊動力的相關性。除飲食成分外，膽石癥模型效果與實驗動物的種屬[25]、品系[26-27]、性別[28]等因素密切相關，構建成石率高、造模周期較短、動物存活率高的簡單、可復制理想模型仍需進一步研究探索。