超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法測定液態奶中的氟他胺和羥基氟他胺

氟他胺（Flutamide）是一類用于治療前列腺癌的抗雄性激素藥物，在臨床上有廣泛的應用[1-3]，其作用機理主要為阻斷雄性激素對前列腺的作用，從而對前列腺腫瘤進行抑制[4]。同時也有研究表明，氟他胺能有效抑制高雄激素血癥[5]，能提高多囊卵巢綜合癥患者的糖代謝能力和脂代謝能力[6]，改善患者的排卵情況[7]。由于其作用為抑制雄性激素，效果與雌激素相似，在乳制品行業中經常被不法商家用于奶牛飼養[8-9]，以達到促進機體成長和促乳的效果[10-11]。我國目前還沒有相關的法律法規規定氟他胺在乳制品中的限量，也沒有相關的國標測定方法。

目前，抗激素類藥物的檢測方法主要有分光光度法[12]、液相色譜法[13-15]和液相色譜串聯質譜法[16-20]。分光光度法需要對目標物進行衍生，且難以同時測定代謝物，分析結果受雜質影響大。液相色譜法分離難度大，檢測器靈敏度較低，適用于藥片或含量較大的樣品測定，對于含量較低的樣品難以檢出，且難以準確定量。液相色譜串聯質譜法則具選擇性強、分析時間短、定性能力高的優點。本文建立了高分辨飛行時間質譜法測定液態乳中的氟他胺及羥基氟他胺，該方法高效、回收率好、結果偏差小，對乳制品中抗激素藥物殘留相關檢測方法的研究有較大的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氟他胺和羥基氟他胺（＞99.0%，上海安譜公司）；甲酸、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚（HPLC級，美國賽默飛公司）；C18、PSA、GCB、硅膠、NH2粉、中性氧化鋁、無水Mg2SO4、NaCl（分析純，上海安譜公司）；超純水。

1.2 儀器與設備

API5600+質譜儀（美國AB SCIEX公司）；LC-20AD液相色譜系統（日本島津公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統（法國Merck Millipore公司）；4k-15離心機（德國Sigma公司）；KQ-800DB超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；Multi Reax渦旋振蕩器（德國Heidolph公司）；Promax 2020搖床（德國Heidolph公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液：分別準確稱取氟他胺和羥基氟他胺標準品于容量瓶中，乙腈稀釋至刻度，得到質量濃度為1 000 mg·L-1的溶液，于-4 ℃保存。

基質曲線：選取陰性樣品按照1.3.2的方法處理，得到空白基質液，稀釋后得到基質曲線，各級濃度為1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1和100 μg·L-1。

1.3.2 前處理方法

稱取2.0 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL 水，渦旋振搖5～10 s，然后加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，加入4.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，振搖15 min。以10 000 r·min-1離 心5 min，準 確 移 取1 mL上 清液，40 ℃氮吹至干，加入1 mL乙腈復溶，轉移至1.5 mL含有100 mg C18粉末的離心管中，渦旋2 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜上機。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進樣量為5.0 μL；柱溫為35 ℃；流動相：流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；洗脫模式：等度洗脫，A∶B=80∶20。

（2）質譜條件。離子源：ESI和APCI復合源，負離子掃描；一級TOF-MS掃描質量范圍（m/z）：50～500 Da；二級IDA-MS掃描準確質量范圍（m/z）：50～500 Da；每10個樣品自動校正1次，負離子模式校正液流速為0.5 mL·min-1；氣簾氣（N2）：35 psi；離子源霧化氣（N2）：45 psi；離子源加熱輔助氣（N2）：45 psi；離子源溫度為450 ℃；離子源電壓-4 500 V。去簇電壓DP為90 V，碰撞能量CE為（30±15）eV；監測模式：TOF-IDA-MS。

1.3.4 數據分析處理

化合物的碎片信息使用Analyst TF 1.6軟件采集，并采用PeakView 2.0、MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件進行進一步的處理，獲得一級離子和二級碎片離子的質荷比、精確分子質量及其同位素比值等。氟他胺和羥基氟他胺的質譜參數見表1。

表1 氟他胺和羥基氟他胺的碎片參數表

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

實驗前期分別使用乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚3種有機溶劑進行實驗，考查對應的回收率。結果顯示，乙腈作為有機溶劑時，對氟他胺和羥基氟他胺的回收率最低，乙酸乙酯和叔丁基甲醚的極性與目標物更為接近，因此回收率較高。此外，雖然叔丁基甲醚沸點要比乙酸乙酯低，更有利于氮氣濃縮，但乙酸乙酯的回收率要略高于叔丁基甲醚。因此綜合考慮，最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。結果詳見圖1。

圖1 不同提取劑對回收率的影響圖

2.2 提取方式的選擇

實驗對比了搖床、超聲和渦旋振蕩3種提取方式。前期對比了提取5 min、10 min、15 min、20 min和25 min時回收率的差異，結果發現3種提取方式在同樣提取時間(15 min）下，回收率基本能達到最優值，提取時間為15 min、20 min、25 min時，實驗結果差別不大，因此為節省實驗時間，選擇提取時間為15 min。其中，渦旋振蕩和搖床的提取方式要較超聲提取更優，回收率均在90%以上。超聲回收率只有70%～80%。實驗結果顯示，渦旋振蕩和搖床回收率相當，最終選擇搖床作為提取方式，結果見圖2。

圖2 不同提取方式對回收率的影響圖

2.3 分散固相萃取劑的選擇

實驗對比了中性氧化鋁、硅膠、C18、PSA、GCB和NH2等6種分散固相萃取劑。中性氧化鋁主要是對目標物進行物理吸附，PSA和NH2對去除樣品中的糖類雜質有較好效果，GCB則可以對具有平面結構的雜質進行吸附，雖然加入后，對基質效應有一定的改善，但同時也對目標物有較嚴重的吸附作用，因此回收率較低。而硅膠相對于其他分散固相萃取劑，對氟他胺和羥基氟他胺的吸附較少，C18對氟他胺和羥基氟他胺的影響最小，氟他胺和羥基氟他胺回收率均在90%以上，因此最終選擇C18進行凈化，不同分散固相萃取劑的回收率見圖3。

圖3 不同凈化劑對回收率的影響圖

進一步對C18用量進行優化，當用量為100～150 mg時，回收率較高，本實驗選擇100 mg為最佳用量，結果詳見圖4。

圖4 不同凈化劑用量對回收率的影響圖

2.4 基質效應

直接提取的方式會使液態乳中的氨基酸、脂肪等物質提取至有機層，雖然方法使用了固相萃取劑進行凈化，但氨基酸、脂肪等雜質的數量級要遠大于目標化合物，因此很可能會存在基質效應，從而影響對數據結果的分析。實驗為了探究基質效應，使用空白基質液配制基質曲線，以其斜率與純溶劑曲線的斜率之比為判定依據。結果顯示，氟他胺呈現基質抑制效應，基質效應為95.07%，在80%～120%，屬于可接受范圍。但羥基氟他胺呈現基質增強效應，基質效應為133.6%，對定量產生影響，所以用空白基質配制曲線進行定量。

2.5 線性關系和檢出限

以濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y進行曲線擬合，得到線性方程和相關系數R2。由表2可知，氟他胺和羥基氟他胺的曲線在1.0～100.0 μg·L-1線性關系良好，相關系數R2大于0.999。同時，通過低濃度加標，按信噪比的3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10），測得氟他胺和羥基氟他胺的方法檢出限均為2.0 μg·kg-1，定量限均為5.0 μg·kg-1，方法靈敏度較高，能滿足測定要求。

表2 氟他胺和羥基氟他胺的線性方程、檢出限和定量限表

2.6 回收率與精密度實驗

以5.0 μg·kg-1、10 μg·kg-1、25 μg·kg-1的濃度水平進行加標回收實驗，每個不同的添加水平于同一天內平行測定6次，并計算出相應的相對標準偏差。氟他胺和羥基氟他胺的平均回收率在94.8%～108.0%，RSD在1.58%～5.58%的范圍內，說明在基質曲線校正定量的情況下，方法的回收率好。數據詳見表3。

表3 不同水平的加標回收率和相對標準偏差表（n=6）

3 結論

本文采用分散固相萃取對提取液進行凈化，通過配制基質曲線校正定量結果，對牛奶中的氟他胺和羥基氟他胺準確定性定量；結合飛行時間質譜測得精確分子量，對氟他胺和羥基氟他胺有較強的選擇性，定性能力更為精確，相對于一般的串聯質譜法，可排除假陽性情況的出現；回收率實驗的結果表明，方法回收率好，精密度高。該方法對日常液態乳中氟他胺和羥基氟他胺的快速篩查和定量分析有較好的適用性，建立一個高通量篩查乳制品中人工喂養的雌激素或類雌激素的方法，對乳制品的質量安全監管有重大的意義。