UPLC-MS/MS法快速測定馬桑蠶蛹中3種馬桑內酯

馬桑蠶（Coriaria sinicasilkworm）又名蓖麻蠶，以馬桑葉為食，故稱之為馬桑蠶[1]。馬桑（Coriaria sinicaMaxim.）是馬桑屬植物，全株有毒，果實毒性最大，因外形與桑葚相似，易被誤食而引發中毒[2]。馬桑毒性成分有羥基馬桑內酯（Tutin）、馬桑寧內酯（Corianin）、馬桑亭內酯（Coriatin）等二環倍半萜內酯毒素[3]。馬桑中毒能引起痙攣、嘔吐等一系列中毒癥狀，嚴重者可致死亡[4]。

目前，有關馬桑毒素的研究主要集中在藥理方面，如殺蟲抑菌等方面[7-8]。含量測定相關報道較少，相關研究主要是對人體血液、尿液及蜂蜜中馬桑內酯進行含量測定[9-11]。針對馬桑蠶蛹中馬桑內酯的檢測方法尚未見報道。

本研究以馬桑蠶蛹為研究對象，建立了馬桑蠶蛹中3種馬桑內酯的超高效液相色譜-串聯質譜儀的分析方法。該方法簡單快速，準確度和精密度高，可以為馬桑蠶蛹進行深加工的質量安全監管提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬桑寧內酯、馬桑亭內酯、羥基馬桑內酯（純度＞98 %）：云南西力生物技術股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：上海安普實驗科技股份有限公司；Oasis PRiME HLB（3cc/150 mg）柱：美國waters公司；實驗室所用水均為超純水。

超高效液相色譜儀（Agilent 1290）、三重四極桿質譜儀（Agilent G6470，配有電噴霧離子源）：美國Agilent公司；刀式研磨粉碎儀（GM200）：德國Retsch公司；超純水機（Milli-Q）：美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

稱取試樣5.00 g，加入20 mL乙腈，超聲提取10 min，4 500 r·min-1離心5 min，取上清液過PRiME HLB柱，棄去前幾滴流出液，收集后續流出液，準確移取2 mL濾液于40 ℃氮吹至近干，用1.0 mL10%乙腈溶液溶解，過膜，供儀器測定。

1.2.2 標準溶液配制

標準儲備液：稱取5 mg（精確至0.1 mg）3種馬桑內酯標準物質，用甲醇溶解并定容至刻度，濃度為1 mg·mL-1的單標儲備液，-18 ℃避光保存。

基質混合標準溶液：用基質溶液配制濃度為10.0 μg·L-1、20.0 μg·L-1、50.0 μg·L-1、100.0 μg·L-1、200.0 μg·L-1以及500.0 μg·L-1的混合標準工作液。

由表2可以看出，使用FLAC3D模擬出的結果誤差最大，單一Elman網絡精度較高，但結合小波-模糊控制Elman網絡的方法精度較單一Elman和FLAC3D，有了顯著的提高，由圖11可看出，小波-模糊控制Elman網絡與拱頂位移變化曲線具有較高的貼合度，并減少了突變點的產生，較前兩種方法，精度有了較大的提高。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）：美國Agilent公司；柱溫為40 ℃；進樣體積為10.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度表

（2）質譜條件。ESI源；負離子模式；多反應監測（Multiple Reaction Monitoring MRM）；毛細管電壓為-3.5 kV；霧化器壓力為40 psi；干燥氣流速為10 L·min-1；鞘氣流速為10 L·min-1；鞘氣溫度為300 ℃；目標物質譜條件見表2。

表2 質譜參數表

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法優化

2.1.1 提取

（1）提取溶劑。研究對提取溶劑的種類進行了考察，選取不同提取溶劑（乙腈、0.1%甲酸-乙腈、乙酸乙酯、0.1%甲酸-乙酸乙酯、甲醇及0.1%甲酸甲醇）對目標物進行提取，結果以回收率表示。結果表明，幾種提取溶劑的提取效率差別明顯，乙腈提取率為70%～79%，0.1%甲酸-乙腈提取率為65%～72%，乙酸乙酯提取率為42%～55%，0.1%甲酸-乙酸乙酯提取率為41%～50%，甲醇提取率為40%～48%，0.1%甲酸甲醇提取率為40%～45%。其中，乙腈提取率最高。進一步比較了不同濃度乙腈的提取效果（見圖1），圖中不同字母表示平均回收率差異顯著（P＜0.05）。隨著乙腈濃度的增加，提取率明顯增大（P＜0.05）。故選用100%乙腈作為提取液。

圖1 乙腈體積分數對目標物回收率的影響圖（n=3）

圖2 超聲提取時間的回收率圖

2.1.2 凈化

蠶蛹中含有豐富的蛋白質、脂肪、磷脂等物質，實驗過程中需對這些物質進行去除，最大程度降低雜質對實驗結果的影響。實驗考察了C18、PSA、PRiME HLB及Oasis HLB不同凈化方法對目標物的凈化效果。結果如圖3所示，使用C18吸附劑凈化時，羥基馬桑內酯和馬桑寧內酯損失較多，回收率均低于40%；使用Oasis HLB固相萃取柱凈化時，馬桑亭內酯和損失較多，回收率較差；使用PSA吸附劑的回收率為65%～69%，PRiME HLB小柱回收率為76%～86%，優于其他3種（P＜0.05）。故實驗選取PRiME HLB小柱。

圖3 不同凈化方法的回收率圖

2.2 儀器條件優化結果

2.2.1 色譜條件的優化

實驗發現使用ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，并采用梯度洗脫程序對目標物有較好的分離度。考察了不同有機相（甲醇、乙腈）和水相（純水和0.1%甲酸溶液）組合的分離效果。結果發現，使用甲醇作為流動相時目標物的響應較好，但馬桑寧內酯和馬桑亭內酯色譜峰重疊；使用乙腈作為流動相時馬桑寧內酯和馬桑亭內酯有較好的分離，且水相中加入0.1%甲酸使目標物的響應較好。因此，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，目標物保留時間見表1，圖4為不同流動相的總離子流圖。

圖4 不同流動相的總離子流圖

2.2.2 質譜條件的優化

參考已有研究[8-9]配制200 ng·mL-1的3種馬桑內酯混標溶液，在負離子模式下一級全掃描得到母離子，在最優碎裂電壓下進行碰撞解離，通過子離子掃描得到定量和定性離子碎片離子信息，優化碰撞能量，并對其他質譜參數進行優化，如毛細管電壓、干燥和鞘氣的溫度及流速等，優化結果見表2。

2.3 基質效應

基質效應計算公式：ME=[（基質匹配標準溶液曲線斜率/無基質標準溶液曲線斜率）-1]×100%。通常，|ME|≤20%時，基質干擾程度較低；|ME|在20%～50%時，為中等程度的基質干擾效應；|ME|≥50%時，表示基質干擾強烈[10]。結果見表3，3種馬桑內酯的均存在基質抑制效應，在檢測過程中采取基質溶液配制標準工作液的方法來降低基質效應干擾。

2.4 方法回歸方程

用基質液配制系列標準工作液，以各組分的峰面積對質量濃度繪制標準工作曲線。結果表明，目標物線性關系良好，相關系數（r）均＞0.992。通過信噪比（S/N=3）計算檢出限（LOD），結果見表3。

表3 回歸方程、相關系數、檢出限、定量限和基質效應表

2.5 回收率和精密度

分別添加低、中、高3個濃度的標準溶液，每個水平做6個平行，結果見表4。3種馬桑內酯的平均回收率在76.6 %～94.1 %，RSD在3.6%～12.6%。

表4 加標回收率和精密度表（n=6）

2.6 樣品測定

使用本研究建立的方法對馬桑蠶蛹及其糞便進行測定，結果馬桑蠶蛹中均未檢出3種馬桑內酯化合物。通過對馬桑蠶蛹的糞便進行測定，發現糞便中3種馬桑內酯均有檢出。

3 結論

建立了馬桑蠶蛹中羥基馬桑內酯、馬桑寧內酯和馬桑亭內酯的UHPLC-MS/MS快速分析方法。結果顯示3種馬桑內酯相關系數均＞0.992，平均加標回收率為76.6%～94.1%，相對標準偏差為3.6%～12.6%（n=6）。利用建立的方法對馬桑蠶蛹及其糞便進行測定，結果發現，馬桑蠶蛹中均未檢出，在其糞便中3種馬桑內酯均有檢出。說明在馬桑蠶蛹在消化馬桑葉的過程中，并未吸收馬桑葉中的馬桑內脂，而是將其通過糞便排出體外。因此，加強馬桑內脂在蠶蛹體內代謝途徑和機理的進一步深入研究，為馬桑蠶蛹綜合利用及產品開發提供科學依據和技術支撐。