補陽還五湯調節血管內皮細胞炎癥信號通路干預高血壓前期血管損傷機制

薛亞楠， 張立德， 王建波， 孫杰， 曲怡*

(1.遼寧中醫藥大學中醫藥創新工程技術中心， 沈陽 110000； 2.中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室， 沈陽 110000)

高血壓作為常見慢性病，是引發心肌梗死、腦出血等心腦血管疾病的最重要危險因素[1]。預計到2025年，全球高血壓患者將達到15億以上[2-3]，因其導致的癡呆患者在2030年將達到7 550萬人[4]。若不對高血壓進行早期干預，其患病率將持續增加，與血壓相關的心血管疾病也將造成全球范圍內較大的經濟負擔[5]。大量研究表明，高血壓與內皮功能障礙有關，內皮功能障礙是一種在宏觀和微循環水平上檢測到的改變[6-8]。內皮在維持血管內環境穩定方面起著至關重要的作用，而內皮功能障礙可使全身血管阻力增加而引起高血壓的發生[9-11]。因此，內皮功能障礙被認為是高血壓病理生理學中的早期事件，是亞臨床靶器官損傷的催化劑[12]。內皮損傷的修復和內皮功能的改善對血壓調節和相應的靶器官保護皆具有重要意義，可能是高血壓患者抗高血壓藥物治療的一個重要靶點。

人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的生物學特征同血管內皮細胞高度相似，接近人體生理狀態，無種屬差異且符合倫理性[13]。補陽還五湯作為益氣活血法的代表方劑被廣泛應用于臨床治療心腦血管疾病，研究證實補陽還五湯不僅能通過糾正高血壓病氣虛血瘀癥的相關基因以及miRNA表達的失衡抑制細胞凋亡[14]，還能通過抑制高血壓腦出血恢復期患者的神經凋亡而改善血液循環提高療效[15]。研究發現，補陽還五湯能有效干預血管內皮功能損傷并加強對內皮功能障礙的逆轉性治療，進而起到良好的保護血管作用。在高血壓病氣虛血瘀證模型的治療中，補陽還五湯通過減少血管內皮細胞損傷標志物的表達起到了保護血管的作用[16]。因此，現從高血壓前期入手，以體外培養的人臍靜脈內皮細胞為觀察對象，以細胞檢測技術為媒介，觀察補陽還五湯對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)炎癥信號通路的反應，探討其防治高血壓前期血管損傷的作用機制，對臨床高血壓病的治療和提高人民生活質量具有重大的意義。

1 材料與方法

1.1 細胞株

選用人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，購于吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物與制備方法

TNF-α配制：將TNF-α粉末(購自南京金斯瑞生物科技有限公司)充分溶解于PBS溶液中，配制成1 μg/mL的母液后于-20 ℃保存，使用時用空白培養基稀釋成工作濃度。

補陽還五湯：黃芪30 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，當歸6 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g，共52.5 g，購自遼寧省中醫院中藥局。用52.5 mL高壓滅菌水溶化藥物，完全溶化后將中藥溶液旋轉蒸發濃縮。反應條件：200 r/min，50 ℃，使用真空冷凝干燥機對濃縮后的藥物進行凍干處理48 h，制成凍干粉。使用超純水溶解凍干粉制備中藥母液，并用0.22 μm濾器過濾除菌，置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3 實驗試劑及儀器

胎牛血清(Gibco公司)；RPMI 1640培養基(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司，批號：P1400)；胰蛋白酶-EDTA消化液(江蘇凱基生物技術股份有限公司，KGY0012)；Trizol(碧云天生物技術，批號：P1275601)；引物設計合成(北京博邁德基因技術有限公司)；HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(CW2582M)；Hoechst 33342(Solarbio)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術，Cat No. P0011)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；NF-κB p65 單克隆抗體(Cat No.66535-1-Ig)、IκB 多克隆抗體(Cat No. 15649-1-AP)。

CO2恒溫培養箱(Thermos scientific)；超凈工作臺(ESCO)；細胞計數儀(LUAII)；高內涵細胞成像和分析系統(Operetta CLS)；熒光定量 PCR儀(Applied Biosysterms 7500)；梯度 PCR 擴增儀(Applied Biosystems)；多功能酶標儀(SpectraMax I3奧地利Molecular Devices公司)。

1.4 細胞培養、分組及造模

HUVECs用含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養基(加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)培養，培養條件：37 ℃、5% CO2、飽和濕度。每48 h更換1次培養基，3 d傳代一次，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化3 min，接種于25 cm2培養瓶，置于6孔板或96孔板中，根據細胞生長狀況收集對數期生長的細胞進行后續實驗研究。

將傳代后的細胞分為5組：空白組、模型組、補陽還五湯低劑量組、中劑量組和高劑量組。待細胞融合至80%左右時，除正常組外，其余4組給予 10 ng/mL TNF-α造模處理，24 h后抽離造模液，空白組和模型組予以10%空白血清培養基，中藥干預組分別予以0.5%、1%、2%補陽還五湯干預處理，各組繼續培養24 h后棄上清液，進行后續不同實驗檢測。

1.5 指標檢測

1.5.1 高內涵觀測細胞數量

收集對數期生長細胞并將其接種至高內涵專用96孔板內，分組造模24 h后加入Hoechst 33342工作液對HUVECs核進行染色，每孔加入100 μL充分覆蓋待染色細胞。在培養箱內培養20 min后棄染色液，PBS洗滌3次后加入含不同濃度的補陽還五湯培養液，放入高內涵儀器內繼續培養24 h，在高內涵自動分析系統中進行細胞數量檢測并拍照。

1.5.2 熒光定量PCR法檢測各組HUVECs內NF-κB信號通路中相關炎癥因子的mRNA的表達

將對數期生長的細胞接種于6孔板，經TNF-α造模及補陽還五湯干預處理后，每孔加入1 mL Trizol裂解液，采用萃取法提取總mRNA，測量RNA濃度后反轉錄為cDNA，熒光定量PCR儀進行擴增，反應條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；擴增引物見表1。

1.5.3 Western blot法檢測各組HUVECs內NF-κB p65和IκB的蛋白表達

將對數期生長的細胞接種于25 cm2培養瓶內，經TNF-α造模及補陽還五湯干預處理后，使用 RIPA 裂解液收集細胞，BCA蛋白定量測定試劑盒進行定量。60 μg蛋白上樣后使用SDS-PAGE電泳及電轉移PVDF膜，37 ℃條件下5%脫脂乳粉封閉1 h，一抗4 ℃過夜，TBST洗滌5次(5 min/次)，HRP標記的二抗37 ℃孵育1 h后用TBST洗滌5次后使用ECL檢測試劑盒進行曝光。GAPDH作為內參對蛋白條帶進行對比分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 補陽還五湯對HUVECs生長增殖的影響

圖1所示的實驗結果表明，10 ng/mL TNF-α造模處理24 h后明顯抑制了內皮細胞的生長增殖。補陽還五湯通過抑制TNF-α誘導的HUVECs損傷促進了細胞增殖，且補陽還五湯中劑量組效果最為明顯。

2.2 補陽還五湯對各組HUVECs內NF-κB信號通路相關炎癥因子mRNA表達的影響

實驗結果顯示，與空白組相比，模型組NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 mRNA表達明顯增加，IκB mRNA表達明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯能明顯抑制NF-κB、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 mRNA的表達，促進IκB mRNA的表達，且中劑量組效果顯著，結果見表2和圖2。

2.3 補陽還五湯對各組HUVECs內NF-κB p65和IκB蛋白表達的影響

結果顯示，與空白組相比，模型組NF-κB p65蛋白表達明顯增加，IκB蛋白表達明顯減少；與模型組相比，中藥干預中劑量組NF-κB p65蛋白表達顯著減少，IκB蛋白表達顯著增加，低劑量組和高劑量組不明顯，結果見表3和圖3。

表2 各組HUVECs內ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 mRNA表達

表1 擴增使用引物

圖1 補陽還五湯對HUVECs生長增殖的影響Fig.1 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the growth and proliferation of HUVECs

與空白組比較，▲代表P<0.05；與模型組比較，●代表P<0.05圖2 各組HUVECs內NF-κB和IκB mRNA表達Fig.2 mRNA expression of NF-κB and IκB in HUVECs of each group

表3 補陽還五湯對HUVECs內NF-κB p65和IκB 蛋白灰度值影響

圖3 各組HUVECs內NF-κB p65和IκB蛋白表達變化Fig.3 Protein expression of NF-κB p65 and IκB in HUVECs of each group

3 討論

內皮功能障礙是高血壓發生發展過程中血管變化的一個核心組成部分，其特征是內皮促炎癥和促血栓反應伴隨血管舒張功能障礙[8,17-18]。高血壓通過各種因素引起血管損傷，壓力水平和血管變化之間是一個周期性和逐漸演化的過程，在這個過程中，因心血管系統紊亂隨著壓力的升高而增加了神經體液活動，反過來導致血管結構和功能的變化，提高了血管阻力，從而使血壓升高[5]。血管內皮功能障礙始發于高血壓前期和(或)中早期，臨床癥狀雖不顯著，但基于中醫“治未病”理論，此階段的中醫治療是干預臨床高血壓的一個重要環節。TNF-α主要是由巨噬細胞產生的炎癥細胞因子，參與了多種代謝性疾病引起的血管內皮細胞功能障礙和血管損害[19-20]。既往研究顯示[21]，在體外培養的 HUVECs 中，TNF-α通過抑制eNOS轉錄能增加氧自由基的表達，證實了炎癥細胞因子TNF-α與高血壓引起的血管內皮細胞功能障礙和心血管的損害有密切關系[22]。綜合已有研究和課題組前期實驗證實，HUVECs高血壓前期損傷模型以TNF-α為造模劑時，造模劑濃度為10 ng/mL，造模時間為24 h時，成功建立HUVECs高血壓前期血管損傷模型。

NF-κB是幾乎存在于所有細胞類型中參與炎癥反應、應激反應、免疫和凋亡等生理病理過程中的調節因子，通常以NF-κB p65/p50二聚體的形式存在于細胞質中[23-26]。NF-κB 信號傳導通過驅動炎癥細胞因子和趨化因子的產生來建立低濃度的炎癥環境，導致免疫細胞的募集而增強炎癥反應。當細胞受到TNF-α刺激時，刺激因子與細胞表面TNF-α受體結合將細胞內的TRAF-6(TNF receptor-associated factor 6)等銜接蛋白募集至細胞膜附近；磷酸化的TRAF-6使IKKβ磷酸化并將其激活，引起下游底物IκBα的磷酸化；細胞內泛素系統的復合物識別被磷酸化修飾的IκBα使之泛素化并被細胞內的蛋白酶體識別并降解，IκB的降解使NF-κB二聚體核易位并發生解離，胞質進入胞核內并與靶基因上的特異性位點結合從而啟動炎性細胞轉錄和表達，產生大量的炎性介質，最終誘發炎癥反應[27-29]。與此同時，NF-κB通過與多種基因啟動子特異性序列結合而上調了包括單核細胞趨化蛋白(MCP-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細胞間黏附分子-1(VCAM-1)的轉錄活性。ICAM-1和VCAM-1是均能介導血管內皮細胞與白細胞黏附的免疫球蛋白超家族成員[30]；MCP-1既是趨化類細胞因子，也是重要的促炎細胞因子，在單核細胞和內皮細胞等不同細胞中均有表達。MCP-1在內皮細胞受損時高表達，通過將單核細胞轉化為巨噬細胞，然后在血管內皮下攝入脂質形成泡沫細胞啟動動脈粥樣硬化，是內皮細胞損傷的早期標志物之一[31-32]。當血管內皮細胞損傷時，炎癥刺激細胞表面而引發內皮細胞發生黏附性改變，內皮細胞被激活并大量分泌ICAM-1、VCAM-1等細胞因子，細胞因子通過與配體的相互作用而介導白細胞與血管內皮細胞發生的黏附性改變，通過刺激內皮細胞收縮等一系列活動引發內皮細胞的損傷和功能障礙[33-35]。

4 結論

模型組NF-κB p65蛋白表達明顯增高，IκB mRNA和蛋白表達均明顯下降，NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1 mRNA表達顯著增多，表明TNF-α造模高血壓前期HUVECs炎癥損傷成功。經中藥治療后，補陽還五湯中劑量組可以顯著下調NF-κB p65蛋白和NF-κB、ICAM-1、VCAM-1和MCP-1的 mRNA表達，上調IκB的蛋白與mRNA表達。表明補陽還五湯通過抑制NF-κB信號通路的激活而緩解了HUVECs的炎癥反應，進而發揮了保護血管的作用。實驗結果說明高血壓前期的血管損傷與血管炎癥反應NF-κB信號通路有關，補陽還五湯中劑量組能糾正該信號通路相關基因表達的失衡，具有抑制高血壓前期內皮細胞損傷的作用。但是，關于高血壓前期血管損傷的研究還不夠深入。課題組擬計劃下一步從動物水平和細胞水平同時進行研究，對臨床高血壓的防治起到警示作用。