桂香溫經止痛膠囊對EMs在位內膜細胞凋亡的調節機制

叢慧芳,李陽,于洋,張天嬋,3*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

子宮內膜異位癥(以下簡稱內異癥)是育齡期婦女的臨床常見病，隨著醫療科技和社會環境的改變，內異癥的發病率增高可達10%～15%[1]。內異癥引起的痛經、性交痛、下腹痛和不孕等，可影響患者的生活和工作，甚至影響患者的心理健康?，F代醫學對內異癥機制的認識主要以子宮內膜細胞隨經血逆流進入盆腔生長為主導。內異癥的形成需要子宮內膜細胞經歷腹水、腹腔細胞吞噬作用后，仍存活在腹膜進行黏附、侵襲和血管形成[2]。

郎景和教授認為內異癥患者與非內異癥患者的在位內膜分子和生物學有差異，并提出“在位內膜決定論”[3]。根據內異癥的在位內膜決定論可知，在位內膜具有更加強大的生存能力。與生存相關的細胞機制包括細胞分裂、凋亡和血管形成等。細胞凋亡是基因調控下的細胞程序性死亡，低凋亡水平可促進組織細胞更好地增殖生長，在腫瘤研究中較多，因內異癥的侵襲轉移等特性與腫瘤相似，故內異癥研究中凋亡機制研究日趨增多[4]。bcl-2屬于抗凋亡因子，是調節線粒體凋亡Bcl-2家族的一員，bcl-2的增加可抑制細胞凋亡[5]。Caspase3是水解酶Caspase家族的一員，可調控晚期凋亡，Caspase3表達增加可以促進細胞凋亡[6]。

西醫對于內異癥的治療以腹腔鏡、卵巢抑制和輔助生殖為主，但在內異癥的早期，疾病不易發現，尚未發現早期比較可靠的血清標志物[7]。中醫對于內異癥引起的癥狀具有很好的緩解作用，可有效縮減病灶，并可在早期進行干預，達到治療效果。叢慧芳教授臨床中治療內異癥頗有心得，并創立桂香溫經止痛膠囊用于臨床治療。前期研究表明桂香溫經止痛膠囊具有很好的臨床療效[8-9]。本研究選取內異癥在位內膜細胞模型，觀察桂香溫經止痛膠囊含藥血清對內異癥細胞模型中細胞凋亡情況，并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 主要藥物及試劑

桂香溫經止痛膠囊：主要成分為肉桂、葫蘆巴、山茱萸、制吳茱萸、醋延胡索、川楝子、鹽小茴香、白芷、川牛膝、細辛、白芍、五靈脂、水蛭。批準文號：黑藥制字Z20160029，此藥為黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院院內制劑，6粒/d，每日3次口服。Vimentin抗體試劑(北京中杉金橋公司)；CK19(北京中杉金橋公司)；MTT溶液(上海富衡生物)；DMEM/F12；PBS緩沖液(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；DMSO(Gibco公司)；RNA提取試劑盒、TRIZOL、dNTP、氯仿、MMLV、異丙醇、DEPC、ddH2O、MgCl2、瓊脂糖、溴化乙錠、MOPS、乙酸鈉、EDTA、溴酚蘭等。

1.2 主要實驗儀器

37 ℃、5%CO2細胞培養箱(賽默飛世爾371)；分光光度計(法國SECOMAM UviLine 9100/9400)；電泳槽(君意JY-SCZ2)；離心機(德國RUMA-ZENTRIFUGENM Z35B80)、Mulitskan酶標儀(美國熱電K3)、實時熒光定量PCR儀(美國羅氏LightCycler480)。

1.3 實驗動物

清潔級SD雌性大鼠20只，體質量(200±20)g，用于制備含藥血清，購買于青島大任富城畜牧有限公司，動物合格證號：SCXK(魯)20140001。實驗室由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～75%。

2 實驗方法

2.1 樣品采集

選取2019年6月—2020年12月于黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院進行開腹手術、腹腔鏡手術切除卵巢子宮內膜異位癥(巧克力囊腫)患者25例，年齡35～49歲，術后病理檢查證實為子宮內膜異位癥，且按1985年美國生育學會修訂EMs(子宮內膜異位癥)分期標準(r-AFS)，全部為Ⅲ～Ⅳ期病例，術后刮取宮腔內子宮內膜組織，標記為EMs組。選擇非EMs而進行子宮切除術的患者16例，年齡35～49歲。術后刮取宮腔內子宮內膜組織，標記為對照組。取得EMs組和對照組的在位子宮內膜組織分別置入2～8 ℃的4 mL DMEM/F12培養液無菌瓶中，置于冰盒中立即送入實驗室，盡快進行細胞的分離培養。內膜組織采集均得到患者知情授權，醫院倫理委員會批準。所有患者既往月經規律，無其他內、外科并發疾病、無炎癥、免疫性及其他惡性疾病，術前1個月內未接受激素類及GnRH類藥物治療。

2.2 含藥血清制備

將40只適應性飼養的SD大鼠隨機分為兩組，桂香組(20只)和空白組(20只)，參照“動物和人體表面積折算的等效劑量比率表”[10]換算給藥，桂香組按照20 mL/kg體質量進行桂香溫經止痛膠囊濃縮劑灌胃，2次/d，連續灌胃5 d，最后1 d 2次灌胃時間相隔2 h；空白組每日按照60 mL/kg體質量進行生理鹽水灌胃，2次/d，連續灌胃5 d，最后1 d 2次灌胃時間相隔2 h，其他喂養環境一致。給藥第7天末次給藥后1.5 h，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)分別麻醉兩組大鼠，開腹并使用負壓采血管于腹主動脈采血，每只約取8 mL，3 000 r/min離心20 min，分離血清后，將同一組血清混合，用0.2 μm微孔過濾膜過濾滅菌，獲得空白血清和桂香血清組血清，置入-20 ℃冰箱保存備用。

2.3 細胞培養及分組

將所取患者的EMs組、對照組在位內膜組織從低溫運送的培養液中取出，生理鹽水清洗。清洗結束后吸凈生理鹽水；將內膜組織加入10倍的消化液，并在消化液中剪碎內膜組織，碎片體積約為1 mm3，剪碎后轉移置離心管中，放入細胞培養箱；離心機離心后，用含有15%胎牛血清及1.5%青鏈霉素(青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL)的DMEM培養液接種于培養皿內，培養成功后進行傳代，取第2～3代生長良好的細胞用于后續檢測實驗。其中EMs組將作為EMs細胞模型進行后續干預實驗，將EMs細胞模型分為4組，分別為空白組、空白血清組、桂香血清組和PI3K抑制劑組，并進行加藥干預。

2.4 細胞鑒定

細胞爬片固定后PBS漂洗，再用0.5%Triton X-100室溫孵育20 min，PBS漂洗2次，滴加3% H2O2，室溫靜置15 min，PBS漂洗。正常山羊血清封閉液滴加蓋玻片，滴加Ⅰ抗(1∶100～1∶200稀釋，鼠抗人角形蛋白CK19或鼠抗人波形蛋白Vimentin)，37 ℃孵育1 h。滴加二抗，37 ℃孵育30 min。PBS漂洗蓋玻片后滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育10～15 min。漂洗后滴加DAB孵育2～10 min顯色，沖洗，脫水，中性樹脂膠封片，光鏡下觀察。

2.5 MTT法不同藥物的最佳干預濃度和干預時間

取生長良好的在位子宮內膜細胞，將細胞計數調整至5×104/mL～10×104/mL，將細胞懸液加入96孔板中，每孔加入100 μL，將接種好的細胞培養板放入37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中正常培養，直至細胞單層鋪滿孔底(或>90%)。將培養好EMs細胞進行分組，分別為空白組、空白血清組、桂香血清組和PI3K抑制劑組，各組設置5個濃度梯度，其中空白血清組和桂香血清組按照2.2中血清濃度進行稀釋，① 空白組：按照正常培養基添加5孔；② 空白血清組：0%、5%、10%、20%、30%；③ 桂香血清組：0%、5%、10%、20%、30%；④ PI3K抑制劑組：0 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L。加入不同培養基后的細胞分別在細胞培養的24 h、48 h、72 h、96 h檢測其增殖能力，檢測時將96孔板每孔培養液吸凈加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，37 ℃繼續培養4 h。在Formazan結晶充分形成后，保留結晶，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩使結晶物充分溶解(避光)。酶標儀波長492 nm，參數620～630 nm，測量各孔的吸光值(OD)。

2.6 RT-PCR技術檢測Caspase3、bcl-2 mRNA的表達

PCR引物通過NCBI中Primer設計，并委托吉林省庫美生物科技有限公司合成引物序列(見表1)，收集各組細胞，TRIZOL試劑裂解的細胞提取總RNA，逆轉錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR儀進行擴增，檢測各目的基因，并采用2-△△Ct方法對結果進行分析計算其表達量。配制好的PCR反應溶液置于PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93 ℃ 1 min預變性，93 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共40個循環。

表1 引物序列

2.7 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對實驗數據進行統計學分析，組間兩兩進行比較，若數據符合正態分布，則采用t檢驗；若數據之間不符合正態分布，采用秩和檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義，并使用Graphpad Prism 8繪制可視化圖進行展示。

3 實驗結果

3.1 細胞鑒定

第三代培養的細胞進行免疫細胞化學染色，波形蛋白存在于間質細胞內，故免疫細胞化學染色選用間質細胞特異的波形蛋白抗體進行[11]，染色后陽性的標志為基質細胞胞架,呈棕黃色，如圖1a所示。角蛋白存在于腺上皮細胞內，故免疫細胞化學染色選用上皮細胞特異的細胞角蛋白抗體進行染色，染色后陽性的標志為腺上皮細胞胞架,呈棕黃色，如圖1b所示。

注：a.波形蛋白抗體；b.角蛋白抗體。圖1 免疫細胞化學染色圖(×400)

3.2 兩組細胞凋亡因子Caspase3和bcl-2 mRNA的表達差異

經熒光定量PCR檢測顯示，與對照組相比，bcl-2 mRNA在EMs組表達較高，差異具有統計學意義(P<0.01)。與對照組相比，Caspase3 mRNA在EMs組表達較低，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 兩組細胞bcl-2和Caspase 3 mRNA表達比較

3.3 MTT法測各組最佳干預劑量

增殖曲線可以看出，5%的含藥血清、10 μmol/L的LY294002為最佳干預劑量，為保持恒定變量，空白血清濃度與含藥血清濃度選擇應一致，根據所選干預劑量對EMs進行干預，以評價含藥血清的治療作用，見圖2。

注：a.空白血清增殖曲線；b.不同劑量含藥血清增殖曲線；c.不同劑量LY294002增殖曲線。圖2 不同樣本增殖曲線圖

3.4 桂香溫經止痛膠囊含藥血清對EMs細胞模型凋亡的影響

3.4.1 4組細胞中Caspase3 mRNA的表達

經熒光定量PCR檢測顯示，Caspase3 mRNA在空白組和空白血清組表達較低，桂香血清組和LY294002組表達較高；其中空白組與空白血清相比，差異無統計學意義(P>0.05)；桂香血清組與LY294002相比，差異無統計學意義(P>0.05)；空白血清與桂香血清組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 4組細胞中Caspase3 mRNA水平比較

3.4.2 4組細胞中bcl-2 mRNA的表達

經熒光定量PCR檢測顯示，bcl-2 mRNA在空白組和空白血清組表達較高，桂香血清組和LY294002組表達較低；其中空白組與空白血清相比，差異無統計學意義(P>0.05)；桂香血清組與LY294002相比，差異無統計學意義(P>0.05)；空白血清與桂香血清組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 4組細胞中bcl-2 mRNA水平比較

4 討論

子宮內膜異位癥為婦科常見難治性疾病，在中醫中屬于“血瘀證”，所致的痛經、不孕等可反復困擾患者。中醫藥在緩解痛經、促進懷孕方面具有良好的臨床效果。叢慧芳教授在臨床中治療內異癥頗有療效，并帶領課題組創立了桂香溫經止痛膠囊，且在臨床治療中得到驗證。

桂香溫經止痛膠囊是叢慧芳教授多年治療寒凝血瘀內異癥的經驗方痛愈舒顆粒經劑型變化而成，使之成為患者接受度更高、更方便攜帶的藥物。此方乃少腹逐瘀湯與當歸四逆湯化裁而來，具有溫經散寒，化瘀止痛之功。少腹逐瘀湯對于寒凝血瘀型的痛經、子宮內膜異位癥等具有很好的治療效果[12]，還可提高內異癥子宮內膜容受性，促進受孕[13]。當歸四逆湯是以桂枝湯為底方，可調和陰陽，再加當歸通草倍大棗，治療寒凝于內的疾病尤為擅長[14]。桂香溫經止痛膠囊以吳茱萸下行溫肝腎，暖胞宮，辛能散結，溫能行血，可入腎散寒為君藥；小茴香、肉桂、葫蘆巴，溫腎陽，散寒瘀，助吳茱萸溫腎散寒；五靈脂、元胡、川楝子止痛化瘀，細辛辛散，可散絡脈瘀滯；水蛭善于搜刮絡脈之瘀，直達病所；細辛化瘀通絡，引諸藥入絡；白芷辛散通竅，與細辛同用，可宣肺理氣；溫陽散寒不可不養血補氣，否則陽無所依，氣無所載，故增加白芍、當歸，活血補血，牛膝引藥下行，山茱萸補肝腎，山藥補后天之本，且可滋陰。補先天養后天，養氣血，使藥物發揮溫腎散寒，活血止痛之功。

BCL-2家族是調控線粒體凋亡的主要相關因子，Bcl-2通過與Bak相互作用，導致線粒體通透性增加，使其中的CytC釋放進入細胞質中，觸發Caspase3的級聯反應而促進細胞凋亡。Bcl-2家族中包含促凋亡因子bax和抑凋亡因子bcl-2。當線粒體凋亡啟動，則會出現bax的活化增加，bcl-2表達降低，從而促進細胞凋亡。有研究表示與非EMs患者相比，EMs患者子宮內膜中Bax表達顯著降低，而bcl-2表達顯著增加，說明EMs與低凋亡水平相關[15]。李斌等[16]同樣對臨床中EMs患者和非EMs患者子宮內膜進行檢測分析，發現EMs在位內膜中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及bcl-2都顯著高于異位內膜組和對照組，而Bax顯著降低。KAYA等人[6]研究發現血清Caspase3水平與EMs的嚴重程度呈正相關。解勝蘭等[17]通過對EMs的在位、異位內膜以及非EMs的在位內膜進行免疫組化法檢測標本中Caspase3、Caspase8的表達，發現其在EMs的異位、在位和對照組中的表達依次下降，且隨著RAFS評分的增加表達量逐漸降低，說明Caspase3、Caspase8的低表達與EMs發生發展相關。故通過對bcl-2、Caspase3的檢測可對細胞凋亡水平進行評價，其中bcl-2體現了線粒體的凋亡情況，Caspase3體現了晚期凋亡情況。本實驗桂香溫經止痛膠囊含藥血清與凋亡抑制劑LY294002相比，具有一致性，均可降低內異癥細胞的增殖，并可通過促進bcl-2 mRNA的表達，抑制Caspase3 mRNA的表達抑制細胞凋亡水平。

綜上所述，本研究說明桂香溫經止痛膠囊可抑制內異癥細胞模型的增殖，使得bcl-2 mRNA表達上調，Caspase3表達下調抑制細胞凋亡，促進內異癥癥狀改善。中藥對疾病的治療屬于整體調理，辨證論治，可涉及多個靶點，多條信號通路。故對中醫藥的研究可更加廣泛。