林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠的抗腫瘤活性研究

黃丹，房慶偉，李坤，葉冠

(上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院，上海 201203)

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根及根莖。人工種植的俗稱“園參”；播種在山林之間天然生長的稱“林下參”。人參莖葉為人參的干燥莖葉，主要有效活性成分是人參皂苷類化合物，如人參皂苷Rg2，人參皂苷Rg3，人參皂苷Rh2等[1]。研究證明人參莖葉總皂苷含量比人參的根部含量高約6%～12%，且所含人參皂苷的藥理活性與人參根所含皂苷基本相同[2-3]，具有開發(fā)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于野山參資源匱乏，近幾年我國大量種植林下參以滿足用藥需求。林下參的生長環(huán)境與野山參相似，其藥用價(jià)值優(yōu)于園參，僅次于野山參[4-5]。目前林下參的主要研究利用部位還僅僅是根[6]，根的生長周期長，莖葉每年都可采摘，廉價(jià)易得，朱海林等[7]研究發(fā)現(xiàn)林下參葉總皂苷含量高于莖、根、籽。然而許多林下參莖葉作為廢棄物丟棄，沒有得到充分利用。目前對(duì)于林下參莖葉的藥理功效相關(guān)報(bào)道甚少，因此研究林下參莖葉的藥理活性具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明人參皂苷是園參根發(fā)揮抗腫瘤作用的主要活性成分[8]。15年以上的林下參與6年生的園參根中主要皂苷種類相似，含量差異較大[9]，14年生林下參的總皂苷含量高于6年生園參，接近10年生野山參的水平[10]，有報(bào)道稱林下參根也具有抗腫瘤活性[11-13]。張?zhí)m蘭等[14]研究發(fā)現(xiàn)5年園參葉與5年、10年、16年林下參葉中皂苷類成分基本一致。園參莖葉總皂苷具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等多種生物學(xué)功能[3,15-17]，為了驗(yàn)證林下參莖葉的抗腫瘤功效，本研究建立了ICR小鼠H22移植瘤動(dòng)物模型，重點(diǎn)比較林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠的抗腫瘤能力的差異，為林下參莖葉功效的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及H22瘤株

SPF級(jí)ICR小鼠100只，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001，使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2017-0040。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫(22±2)°C，濕度50%，自由進(jìn)食、飲水。小鼠H22肝癌細(xì)胞由南京恩晶生物科技有限公司提供(貨號(hào):EGC185)，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 主要藥品

園參莖葉總皂苷(人參莖葉總皂苷含量77.37%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為34.06%);林下參莖葉總皂苷(人參莖葉總皂苷含量77.07%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為37.46%)，均為實(shí)驗(yàn)室自制，制法參考2020版《中國藥典》。實(shí)驗(yàn)用園參莖葉及林下參莖葉樣品經(jīng)葉冠教授級(jí)高級(jí)工程師鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥莖葉。參一膠囊購于吉林亞泰制藥股份有限公司(批號(hào):20191203)。

1.3 主要試劑

D101大孔樹脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20181127)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20181225)；免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)分別為MM-0057M1、MM-0058M1、MM-0182M1、MM-0701M1、MM-0132M1)；PE anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4、FITC anti-mouse CD8(北京四正柏生物科技有限公司，批號(hào)分別為4AD122130F、4AD122131F、4AD122131F)。

1.4 主要儀器

BHC-1300A/B2生物潔凈安全柜(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋SANYO)；XD-202熒光倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)；0-150型游標(biāo)卡尺(臺(tái)灣西南佳華精密量具有限公司)；BSA 224S電子天平(德國賽多利斯公司)；熱電MultiskanFC酶標(biāo)儀(Thermo)；SCILOGEX臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(SCILOGEX)；Attune NxT流式細(xì)胞儀(Thermo)。

1.5 造模及分組方法

取生長旺盛期的H22肝癌細(xì)胞，在無菌條件下，接種于90只ICR小鼠右側(cè)腋窩皮下，細(xì)胞接種量為1×106。造模周期2～3周。小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測(cè)量直徑，待腫瘤生長至100 mm3左右時(shí),挑選生長狀態(tài)良好且腫瘤大小均一性較好的荷瘤裸鼠80只，隨機(jī)分成8組，每組10只，另外設(shè)置空白對(duì)照組，共9組。分別為空白對(duì)照組(NC組)、模型組(M組)、林下參莖葉總皂苷低劑量組(LXD組)、林下參莖葉總皂苷中劑量組(LXZ組)、林下參莖葉總皂苷高劑量組(LXG組)、園參莖葉總皂苷低劑量組(YSD組)、園參莖葉總皂苷中劑量組(YSD組)、園參莖葉總皂苷高劑量組(YSG組)及陽性對(duì)照組(SY組)。

1.6 藥物配制及給藥劑量

空白對(duì)照組和模型組，給予生理鹽水，按10 mL·kg-1灌胃給藥；林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組，園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組，藥品皆用適量DMSO溶解后，生理鹽水稀釋，配制藥物濃度10、20、40 mg·kg-1，給藥體積0.2 mL·20 g-1，灌胃給藥。陽性對(duì)照組，參一膠囊每粒膠囊含人參皂苷10 mg，用生理鹽水溶解膠囊，用藥濃度10 mg·kg-1，給藥體積0.2 mL·20 g-1，灌胃給藥。1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.7 相對(duì)腫瘤增殖率、抑瘤率及免疫器官指數(shù)的測(cè)定

相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)、抑瘤率及免疫器官指數(shù)的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[18-19]。

1.8 小鼠外周血淋巴細(xì)胞及其亞群分布測(cè)定

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞。各組小鼠眼眶取血，取全血50 μL，依次加入CD3+-PE、CD4+-FITC、CD8+-FITC單克隆抗體，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)數(shù)，計(jì)算CD3+CD4+細(xì)胞與CD3+CD8+細(xì)胞的比例。

1.9 血清指標(biāo)及細(xì)胞因子測(cè)定

ELISA方法檢測(cè)血清TNF-α、IFN-γ、IL-2、IgG、IgM水平。小鼠摘眼球取血，血液樣本經(jīng)3 000 r·min-1離心10 min后，分離血清，測(cè)定血清中IgG、IgM；外周血檢測(cè)TNF-α、IFN-γ、IL-2的含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間無小鼠意外死亡情況。隔天1次測(cè)量腫瘤直徑，給藥14 d后，小鼠處死當(dāng)天(第15天)林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組對(duì)H22荷瘤小鼠的相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)分別為70.0%、51.0%、34.5%，抑瘤率分別為21.2%、43.1%、60.4%；園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組對(duì)H22荷瘤小鼠的相對(duì)腫瘤增殖率T/C(%)分別為77.9%、60.3%、40.5%，抑瘤率分別為19.0%、37.8%、54.7%；陽性對(duì)照組對(duì)H22裸小鼠移植瘤的T/C(%)為30.5%，抑瘤率為62.7%。與模型組比較，受試藥物對(duì)H22荷瘤小鼠異種移植瘤生長均有一定的抑制作用，瘤重明顯減輕(P<0.01)；林下參莖葉總皂苷中、高劑量組的瘤重較園參莖葉總皂苷對(duì)應(yīng)中、高劑量組明顯更低(P<0.05)，結(jié)果見表1。表明不同劑量林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠異種移植瘤生長均有一定的抑制作用，且林下參莖葉總皂苷中、高劑量組抗小鼠肝癌活性略強(qiáng)于園參莖葉總皂苷對(duì)應(yīng)中、高劑量組。

表1 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

2.2 對(duì)H22荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響

給藥14 d后，與模型組比較，林下參莖葉總皂苷高劑量組脾縮小，脾指數(shù)明顯降低(P<0.05)，林下參莖葉總皂苷高劑量組較園參莖葉總皂苷對(duì)應(yīng)高劑量組脾指數(shù)明顯更低(P<0.05)，其他各組小鼠脾指數(shù)與模型組基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)亦觀察H22荷瘤小鼠胸腺指數(shù)，結(jié)果顯示，給藥14 d后各組小鼠胸腺指數(shù)與模型組基本一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。林下參莖葉總皂苷高劑量組對(duì)小鼠脾臟免疫功能略有損傷，其他各組對(duì)ICR荷瘤小鼠免疫功能沒有顯著影響，結(jié)果見表2。

2.3 對(duì)H22荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞含量比例的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞含量比例結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比，模型組小鼠血液CD3+CD4+含量比例明顯降低(P<0.01)；CD3+CD8+含量比例明顯升高(P<0.01)；與模型組比，陽性對(duì)照組，林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組和園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組CD3+CD4+含量比例明顯升高，CD3+CD8+含量比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，結(jié)果見表3。比較林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組與園參莖葉總皂苷對(duì)應(yīng)低、中、高劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞含量比例，低劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞含量比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中、高劑量組CD3+CD4+無明顯差異(P>0.05)，CD3+CD8+細(xì)胞含量比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷能顯著促進(jìn)H22荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+細(xì)胞的表達(dá)，降低CD3+CD8+細(xì)胞表達(dá)水平。

表2 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)影響

2.4 對(duì)H22荷瘤小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠IgG、IgM、IFN-γ、IL-2、TNF-α水平與空白對(duì)照組小鼠比較顯著降低(P<0.01)；陽性對(duì)照組，林下參莖葉總皂苷低、中、高劑量組和園參莖葉總皂苷低、中、高劑量組小鼠IgG、IgM、IFN-γ、IL-2、TNF-α水平與模型組小鼠比較明顯升高(P<0.01)，結(jié)果見表4。園參莖葉總皂苷和林下參莖葉總皂苷對(duì)荷瘤小鼠免疫增強(qiáng)均有良好的效果，在同等劑量的情況下，林下參莖葉總皂苷的效果略優(yōu)于園參莖葉總皂苷，IgG、IgM、IL-2、TNF-α結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IFN-γ高劑量無明顯差異(P>0.05)，中、低劑量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞含量比例的影響

表4 林下參莖葉總皂苷與園參莖葉總皂苷對(duì)H22荷瘤小鼠血清中的IgG 、IgM、 IFN-γ、IL-2、TNF-α水平比較

3 討論

肝癌在中醫(yī)癥狀中屬于“肝積”“臌脹”“脅痛”“虛勞”等范疇，多因氣滯、血瘀、毒聚等引起。機(jī)體正氣被逐漸損傷，導(dǎo)致肝脾陽虛，進(jìn)而腎陰虧虛，形成惡性循環(huán)。如《金匱要略》所言：“夫治未病者，見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”，脾虛是肝癌病理病機(jī)的重中之重。人參入脾、腎經(jīng)，具有補(bǔ)脾益肺、大補(bǔ)元?dú)獾墓π?，能提升機(jī)體的免疫力。中醫(yī)理論認(rèn)為，人參能輔助提高正氣，從而增強(qiáng)抗邪毒的能力。

參與機(jī)體細(xì)胞免疫的主要是T淋巴細(xì)胞，包括輔助性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+)，CD3+CD4+比值降低，CD3+CD8+占比上升提示機(jī)體免疫細(xì)胞受到抑制或損傷[20-21]。本研究顯示，林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷作用于H22荷瘤小鼠后，CD3+CD4+比值上升，CD3+CD8+細(xì)胞占比下降，說明林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷能激活CD3+CD4+細(xì)胞，增強(qiáng)細(xì)胞免疫，發(fā)揮抗肝癌作用。T淋巴細(xì)胞在惡性腫瘤發(fā)生的情況下會(huì)釋放細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，TNF-α能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無害[22]，IFN-γ由活化的NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞分泌，具有抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫的作用[23]，IL-2通過增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫[24]。林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷可以使荷瘤小鼠血清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平明顯升高，說明林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷能通過促進(jìn)免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生，達(dá)到抗肝癌作用。血清中抗體IgG、IgM的含量直接反映體液免疫功能，林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷可以使荷瘤小鼠血清中IgG、IgM水平顯著上升，說明它們可以增強(qiáng)H22荷瘤小鼠體液免疫功能。

綜上所述，林下參莖葉總皂苷和園參莖葉總皂苷可能通過增強(qiáng)免疫來抑制H22肝癌細(xì)胞的生長，林下參莖葉總皂苷中、高劑量組比園參莖葉總皂苷對(duì)應(yīng)劑量組具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。本文研究結(jié)果可為開發(fā)針對(duì)肝細(xì)胞癌癥新型治療策略提供一定的線索，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用林下參莖葉資源具有重要意義，但需要更多的臨床研究證實(shí)林下參莖葉總皂苷在腫瘤治療中抑制腫瘤生長，增強(qiáng)細(xì)胞免疫的有效性，并探討詳細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制。