高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測阿奇霉素原料藥及其制劑中6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)*

郝麗娟，徐艷梅，高燕霞△，劉 峰，崔巧利

（1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院·仿制藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050227；2.石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)<石家莊>有限公司·河北省制技工程技術(shù)研究中心·新型藥物制劑與輔料國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035）

阿奇霉素是首個(gè)十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，化學(xué)名為9a-甲基-9-脫氧-9a-氮雜-9a-同紅霉素A，由紅霉素A經(jīng)過肟化、貝克曼重排、還原、甲基化等一系列反應(yīng)制備而成［1-2］，主要用于治療呼吸道、軟組織、泌尿系統(tǒng)疾病及皮膚感染等，療程短，副作用少［3］。基因毒性雜質(zhì)是可以造成基因突變或體內(nèi)誘變的物質(zhì)，痕量即可引起癌變、畸變［4］。纈沙坦、雷尼替丁、二甲雙胍中先后檢出N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)，《世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)致癌物清單》已將多個(gè)N-亞硝胺類化合物歸為A類致癌物質(zhì)。其產(chǎn)生的原因可能與工藝過程、降解途徑、污染引入等有關(guān)［5-6］。阿奇霉素的11位糖環(huán)上存在二甲胺基結(jié)構(gòu)，是典型基因毒性雜質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)，且原料藥的合成過程存在亞胺類中間體，易通過氧化等途徑引入基因毒性雜質(zhì)［7-8］。起始原料紅霉素A和阿奇霉素注射劑中均檢出亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺（NDMA）［9-10］。我國為全球重要生產(chǎn)國和出口國，國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站公布的600多種阿奇霉素藥物的注冊(cè)申報(bào)和出口都需要對(duì)其N-亞硝胺類雜質(zhì)進(jìn)行研究，但目前未見關(guān)于檢測阿奇霉素藥物中N-亞硝胺類雜質(zhì)的相關(guān)研究。參照各國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的通用檢查方法［11］并參考文獻(xiàn)［12-14］，本研究中建立了測定阿奇霉素原料藥及其制劑中6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLCMS/MS）法，方法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，為有效控制阿奇霉素及其制劑中的基因毒性雜質(zhì)提供了依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-30AD型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SCIEX ATRAP 6500型質(zhì)譜儀（美國AB公司）；XS105型電子天平（瑞士Mettler Toled公司，精度為十萬分之一）；Milli-Q型純水制造系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

NDMA對(duì)照品（TMstandard公司，批號(hào)為1681903，含量以99.9%計(jì)）；N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）對(duì)照品（批號(hào)為51-KFA-33-1，含量以100%計(jì)），N-亞硝基二乙胺（NDEA）對(duì)照品（批號(hào)為50-GHZ-66-1，含量以100%計(jì)），均購自加拿大TRC公司；N-亞硝基乙基異丙胺（NEIPA）對(duì)照品（批號(hào)為D10252828，含量以100%計(jì)），N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）對(duì)照品（批號(hào)為D10252827，含量以100%計(jì)），N-亞硝基二丁胺（NDBA）對(duì)照品（批號(hào)為D10252829，含量以100%計(jì)），均購自HIC公司；甲醇（色譜純，德國默克股份有限公司）；水為超純水。抽檢樣品：阿奇霉素（原料藥，批號(hào)分別為108200513，108200514，108200518）；阿奇霉素腸溶片（批號(hào)為FAR2901005）；阿奇霉素膠囊（批號(hào)為21012001）；阿奇霉素干混懸劑（批號(hào)為207210201）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 3 C18-AR柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.6 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.1.2 質(zhì)譜條件

電離模式：正離子；離子源：大氣壓化學(xué)電離（APCI）源；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；中性（NC）電流：3 mA；氣簾氣（CUR）：206.8 kPa；霧化氣（GS1）：241.3 kPa；離子源溫度：350℃。6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)Tab.2 Retention time and HPLC-MS/MS parameters of the six N-nitrosamine genotoxic impurities

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別取6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)對(duì)照品適量，精密稱定，加水稀釋并定容，制成NDMA，NMBA和NDEA，NEIPA，NDIPA，NDBA的質(zhì)量濃度分別為265 μg/mL和960 μg/mL的混合對(duì)照品貯備液。取上述混合對(duì)照品貯備液各適量，用水逐級(jí)稀釋制得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液（NDMA和NMBA的系列質(zhì)量濃度分別為48.00，24.00，4.80，2.40，0.96，0.48 ng/mL，NDEA，NEIPA，NDIPA，NDBA的系列質(zhì)量濃度分別為13.25，6.62，1.33，0.66，0.26，0.13 ng/mL）。

供試品溶液：取原料藥0.5 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水5 mL，渦旋5 min，用水稀釋并定容，振搖10 min，以4500 r/min的速率離心10 min，制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，濾過，取續(xù)濾液，即得原料藥供試品溶液。取樣品（或內(nèi)容物）20片（或粒、袋）研細(xì)，混勻，取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于阿奇霉素0.5 g），精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水5 mL，渦旋5 min，用甲醇稀釋并定容，振搖10 min，以4500 r/min的速率離心10 min，濾過，制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL的溶液，取續(xù)濾液，即得制劑供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取空白溶劑及2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、原料藥供試品溶液、制劑供試品溶液，按2.1項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)均無干擾峰，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.NDMA 2.NMBA 3.NDEA 4.NEIPA 5.NDIPA 6.NDBAA.Blank solvent B.Mix reference solution C，D.Test solution（azithromycin API and its preparations，respectively）Fig.1 HPLC-MS/MS chromatograms of the specificity test

線性關(guān)系考察、檢測限和定量限確定：取2.2項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，NDMA，NMBA和NDEA，NEIPA，NDIPA，NDBA質(zhì)量濃度分別在0.48～48.00 ng/mL和0.13～13.25 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。分別以混合對(duì)照品溶液信噪比（S/N）為3∶1和10∶1的質(zhì)量濃度為檢測限與定量限。結(jié)果見表3。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件平行測定6次。結(jié)果見表3，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別于室溫放置0，1，2，3，6，10 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3，表明對(duì)照品溶液在室溫下放置10 h穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取原料藥樣品（批號(hào)為108200513），依法平行制備供試品溶液6份，分別量取對(duì)照品溶液適量，同法制備加標(biāo)供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取原料藥樣品（批號(hào)為108200513），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共9份，分別精密加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，制備成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度，各3份，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，并按外標(biāo)法計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表3 方法學(xué)考察結(jié)果Tab.3 Results of the methodological investigation

耐用性試驗(yàn)：更換流動(dòng)相流速（0.4，0.8 mL/min），起始柱溫（35，45℃），流動(dòng)相B起始比例（0，4%）、不同品牌色譜柱進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，小范圍的改變測定條件，色譜峰峰面積變化不大，表明方法耐用性良好。

強(qiáng)制降解試驗(yàn)：取原料藥樣品（批號(hào)為108200513）4份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化和加熱（乙腈溶解，沸水浴）破壞試驗(yàn)，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果降解產(chǎn)物中均未檢出6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)。色譜圖見圖2。

圖2 強(qiáng)制降解試驗(yàn)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖A.Strong acid damage B.Strong alkali damage C.Heating damage D.Oxidation damageFig.2 HPLC-MS/MS chromatograms of the forced degradation test

2.4 樣品檢測

分別取3批（批號(hào)分別為108200513，108200514，108200518）阿奇霉素原料藥和3批（批號(hào)分別為FAR2901005，21012001，207210201）阿奇霉素制劑，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果3批阿奇霉素原料藥和3批制劑中均未檢出6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)。

3 討論

3.1 提取方法選擇

以各成分的提取率為指標(biāo)，考察了甲醇、乙醇、水、50%甲醇等提取溶劑及前處理方法，最終選擇水作為溶劑，前處理方法采用先渦旋后振搖、再離心，以提高各成分的回收率。

3.2 色譜條件選擇

考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，各成分色譜峰峰形及分離度均良好，12 min內(nèi)可完全洗脫。

考察了Waters XBridge C18柱、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱、XSelect HSS T3柱、ACE Excel 3 C18-AR柱等色譜柱，結(jié)果以ACE Excel 3 C18-AR柱為色譜柱時(shí)，各成分色譜峰峰形良好，分離度較高。又通過對(duì)柱溫及梯度洗脫程序的調(diào)整，進(jìn)一步提高了分離效率，最終確定2.1.1項(xiàng)下色譜條件。

3.3 方法評(píng)價(jià)

阿奇霉素與敏感微生物的50s核糖體的亞單位結(jié)合后，對(duì)其蛋白質(zhì)的合成產(chǎn)生干擾，體外試驗(yàn)和臨床研究均表明，阿奇霉素對(duì)多種革蘭陽性菌、革蘭陰性菌需氧致病菌有良好的抑菌效果，臨床用途廣泛。其分子中含有伯胺、仲胺結(jié)構(gòu)，具有典型基因毒性致癌物的警示結(jié)構(gòu)，在制備和儲(chǔ)藏過程中易產(chǎn)生N-亞硝胺類雜質(zhì)。本研究中建立了測定阿奇霉素原料藥及其制劑中6種N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)的HPLC-MS/MS法，強(qiáng)制降解產(chǎn)物中均未檢出這6種雜質(zhì)，推測此類基因毒性雜質(zhì)為工藝雜質(zhì)，應(yīng)對(duì)原料生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)和步驟進(jìn)行嚴(yán)格控制。方法學(xué)考察結(jié)果表明，所建立的方法操作簡便、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于生產(chǎn)企業(yè)及藥監(jiān)系統(tǒng)日常檢查，監(jiān)測阿奇霉素原料藥及其制劑中的N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)。