高效液相色譜法測定血清中胺碘酮濃度*

吳靜華，林志燕，黃曉會

（上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海 200092）

胺碘酮屬廣譜抗心律失常藥，20世紀70年代末開始在國內臨床使用，主要用于治療室上性及室性心律失常的第三類抗心律失常，生物半衰期可達50 d，治療范圍較窄［1］，三室分布，個體差異較大，且為高度親脂性化合物，起效較慢，需長期服用，但長期用藥有蓄積中毒風險，故需監測血藥濃度［2-3］，并結合患者的臨床指標進行個體化給藥治療。目前，采用高效液相色譜法與薄層色譜法監測胺碘酮血藥濃度，而薄層色譜法的定量限較高（均大于2.5 mg/L［4-5］），高效液相色譜法可達到更低的檢測限（0.275 mg/L）。已有研究中，大部分高效液相色譜法樣本前處理采用液液萃取后再吹干，步驟煩瑣且耗時較長［6-8］。也有研究采用熒光光譜法進行檢測［9］，但應用較少，不利于推廣。本研究中采用蛋白沉淀法對樣本進行前處理，并采用高效液相色譜二極管陣列檢測器快速測定血清中胺碘酮的濃度，采用外標法定量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；5424R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Milli-Q型純水儀（美國Millipore公司）；Vortex KB3型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；MSE125P-100-DU型電子天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

胺碘酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100065-201006，純度為100%）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；三乙胺及乙酸均為分析純，水為純化水；血清樣本為我院提供的健康人群血樣。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：醋酸鹽緩沖液（pH 5.8）-甲醇-乙腈（15∶55∶30，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：242 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。

2.2 樣本前處理

取血清樣本200 μL，置1.5 mL EP管中，加入乙腈400 μL，渦旋振蕩1 min，以13000 r/min的速率離心10 min，取上清液20 μL進樣分析。

2.3 溶液制備

標準貯備液：精密稱取胺碘酮對照品8.80 mg，用乙腈溶解，定容至100 mL容量瓶中，配制成質量濃度為88 μg/mL的標準貯備液，-80℃貯存備用。

基質加標溶液：取空白血清900 μL，加入質量濃度為88 μg/mL的標準貯備液100 μL，配制成質量濃度為8.8 μg/mL的基質加標溶液。

醋酸鹽緩沖液：取1000 mL純化水，置流動相瓶中，加入1 mL三乙胺和1 mL乙酸，超聲10 min，即得。

質控血清樣本溶液：精密量取空白血清800 μL，加入質量濃度為88 μg/mL的胺碘酮標準貯備液200 μL，用空白血清稀釋成質量濃度分別為17.600，8.800，4.400，2.200，1.100，0.550，0.275 μg/mL的系列血清樣本，同時稀釋得低、中、高質量濃度分別為0.55，2.20，8.80 μg/mL的質控血清樣本溶液。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：分別取空白血清適量，加標準貯備液，即得胺碘酮標準品溶液，按2.2項下方法處理血清樣本，按2.1項下色譜條件進樣分析。結果顯示，胺碘酮與血清中內源性物質分離完全，對測定結果無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖1.AmiodaroneA.Amiodarone standard solution B.Blank serum C.Blank serum adding standard stock solution of amiodaroneFig.1 HPLC chromatograms of the specificity test

線性關系考察：取2.3項下質控血清樣本溶液適量，以胺碘酮峰面積（Y）為縱坐標、血清樣本質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=19.3X-4.9234，r=0.9998（n=7）。結果表明，血清樣本的質量濃度在0.275～17.600 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.3項下質量濃度分別為0.55，2.20，8.80 μg/mL的質控血清樣本溶液各5份，于1 d內按2.2項下方法進行樣本前處理后進樣分析，考察日內精密度；連續3 d按2.2項下方法進行樣本前處理后進樣分析，考察日間精密度。結果日內精密度試驗的RSD分別為1.25%，1.96%，2.06%（n=5），日間精密度試驗的RSD分別為3.68%，3.99%，4.59%（n=5），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：分別取2.3項下質量濃度為0.55，2.20，8.80 μg/mL的質控血清樣品溶液各3份，按2.2項下方法進行樣本前處理，將上清液在室溫下分別放置4，24，48 h后，按2.1項下色譜條件重復進樣測定，計算變異系數（CV）；將配置好的血清質控標本置-4℃冰箱分裝保存，每隔1周復測1次，低、中、高質量濃度水平分別平行測3組，計算CV。結果顯示，胺碘酮的血清樣品在上述情況下穩定性良好，測定CV<10%。

加樣回收試驗：取空白血清，加標準貯備液，配制成質量濃度分別為0.55，2.20，8.80 μg/mL的血清樣本，平行5份，按2.2項下方法進行樣本前處理，按2.1項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率。結果見表1。

表1 空白血清中胺碘酮加樣回收試驗結果（n=5）Tab.1 Results of the recovery test of amiodarone in the blank serum（n=5）

3 討論

3.1 流動相選擇

首先選取了甲醇-磷酸鹽緩沖液（90∶10，V/V）作為流動相，以1 L水加1 mL三乙胺和470 μL磷酸制備磷酸鹽緩沖液，色譜峰出現裂縫；后又調整流動相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（95∶5，V/V），結果色譜峰峰寬較寬，不符合檢測要求。參考文獻［10-11］，調整流動相為乙腈-甲醇-0.01 mol/L醋酸銨溶液（30∶55∶15，V/V/V），流速為1 mL/min，保留時間為45 min，檢測時間太長。又進行緩沖鹽的調整，將保留時間縮短，最終確定緩沖液為醋酸鹽緩沖液（pH 5.8）-甲醇-乙腈（15∶55∶30，V/V/V）。

3.2 樣本前處理方法選擇

查閱文獻，選擇了前處理試劑，采用同一標準樣本進行處理：1）200 μL樣本+200 μL酸化劑+200 μL甲醇；2）200 μL樣本+200 μL酸化劑+200 μL乙腈；3）200 μL樣本+400 μL甲醇；4）200 μL樣本+400 μL乙腈。結果顯示，4種方案均無干擾成分干擾目標峰，方案4）回收率更高，操作簡單、準確，檢測限更低［7-8］，靈敏度均可達到血藥濃度檢測的標準，故選擇2.2項下方法對樣本進行處理。

3.3 檢測波長選擇

本研究中通過高效液相色譜儀的光譜掃描，首先確定最大吸收波長范圍。發現242 nm波長處吸收較大，通過驗證，242 nm波長處的響應值高，且雜質干擾較少，故檢測波長選擇242 nm。

3.4 臨床應用

采用本方法對本院10名服用胺碘酮的患者進行血藥濃度監測，其中2例為兒童，8例為大于60歲的老年患者，其中3例老年患者為定期監測，測得藥物谷濃度為（0.68±0.12）μg/mL。證明胺碘酮對多種難治性心律失常有較好療效，負荷劑量的大小決定起效時間，需要快速控制的嚴重室性心律失常患者使用較大負荷劑量時，應進行血藥濃度監測，及時進行個體化給藥方案調整，以保證用藥的安全性及有效性。有研究報道，胺碘酮達效質量濃度范圍95%為0.5～2.0 μg/mL，建議以0.5～2.0 μg/mL為有效血藥濃度［12］。血藥濃度大于2.5 μg/mL與神經系統和胃腸道不良反應的增加有關［13-14］。胺碘酮的中毒濃度在3.0 μg/mL以上［15］。由于胺碘酮半衰期長，且易蓄積，需密切監測其血藥濃度變化，以進行個體化給藥，防止致命性心律失常發生。目前，對濃度靶值及毒性閾值缺乏權威的有力證據，本研究中收集的樣本過少，后期將收集更多數據，結合臨床效果，分析有效的血藥濃度范圍。