基于網絡藥理學—分子對接探討四逆散治療潰瘍性結腸炎的作用機制

★ 鄭秋霞 陳艷紅 林遠茂 林曉濤 孫誠攻 張榮欣 姜楓（.廣西中醫藥大學 南寧 530000；.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 南寧 5300）

潰瘍性結腸炎( ulcerative colitis，UC)是一種影響結腸的慢性非特異性腸道炎性疾病，其患病率隨著社會經濟的不斷發展呈快速上升趨勢[1］。本病的病因目前尚未完全明確，一般認為與遺傳、免疫、感染和精神心理因素等有關[2］，病程長期反復，治療難度大[3］。近年來，中醫藥在潰瘍性結腸炎的治療方面做出了卓越的貢獻，可緩解西藥帶來的不良反應，降低UC復發率，提升治療安全性等作用。在中醫學中可將本病歸于“痢疾”“泄瀉”“腹痛”等范疇[2］。《傷寒論》云：“少陰病……或腹中痛，或泄利下重者，四逆散主之。”[4］方中柴胡與白芍合用，疏肝解郁、養血條肝；枳實與白芍合用，理氣和血，甘草調和諸藥，多用于治療腹痛即瀉，食欲不振，脘腹滿悶，善太息等肝脾氣機不調的一類潰瘍性結腸炎[5］。本文主要通過近年來較為熱門的網絡藥理學及分子對接技術，預測四逆散治療潰瘍性結腸炎的有效靶點及作用機制，將有效靶點與君藥有效化合物進行分子對接，模擬靶點蛋白受體與化合物小分子結合情況，為進一步的實驗研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 四逆散有效化合物-靶點篩選

利用中藥系統藥理數據庫TCMSP檢索四逆散全方四味中藥：柴胡、枳實、白芍、甘草，搜索框選擇“Herb name”，輸入中藥名，以口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為標準進行篩選，得出每味中藥對應的活性成分名稱；搜索框選擇“Chemical name”，逐個輸入上一步所得活性成分名稱，得到活性成分對應靶點蛋白。

1.2 四逆散靶點-基因篩選

利用蛋白質數據庫UniProt標準化靶點蛋白名稱，條件選擇“Reviewed”和“Human”后導出數據，運用表格函數VLOOKUP匹配出靶點蛋白的基因靶點，對于函數匹配失敗且無法從UniProt數據庫檢索出結果的靶點蛋白，予舍去。

1.3 中藥-化合物-靶點網絡構建

對四逆散中四味中藥的活性化合物、基因靶點進行整理，去除重復的化合物、基因靶點，找出四味中藥之間的重復成分，建立包含中藥、化合物、靶點的網絡文件及其屬性文件，導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建中藥-化合物-靶點網絡關系圖。

1.4 UC相關基因的篩選及PPI網絡構建

利用人類基因數據庫GeneCards檢索疾病潰瘍性結腸炎相關基因，以“ulcerative colitis”為檢索詞，收集潰瘍性結腸炎相關基因，結合四逆散的基因靶點，利用生物信息學與進化基因組學繪制維恩圖，得出四逆散治療UC的相關作用靶點，并將作用靶點導入STRING數據庫，研究物種設置為“Homo sapiens”,構建PPI蛋白網絡互作圖，以TSV格式導出網絡圖，輸入Cytoscape 3.6.0軟件，根據其Degree值對各個節點進行調節、著色。

1.5 GO分析及KEGG通路分析

將上一步驟維恩圖得出的交集靶點輸入DAVID數據庫，標識符設置為OFFICIAL GENE SYMBOL,物種設置為Homo sapiens,分別導出基因本體功能分析的生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）以及KEGG通路富集分析，對BP、CC、MF分析結果中前十者進行柱狀圖繪制，對KEGG分析結果進行兩次MEDIAN函數運算后，再進行氣泡圖繪制，柱狀圖及氣泡圖繪制主要利用微生信數據庫；運用Cytoscape 3.6.0軟件，構建交集靶點-信號通路-生物功能網絡關系圖。

1.6 分子對接情況

選取PPI網絡圖中排名前6的靶點蛋白，利用STRING數據庫獲取靶點蛋白PBD編號，在RCSB PDB數據庫中檢索出蛋白結構，若該蛋白沒有編號則直接在RCSB PDB數據庫檢索靶點名稱，選取分辨率較低蛋白結構，以PDB格式導出；利用TCMSP數據庫檢索君藥-柴胡化學成分的小分子結構，以MOL2格式導出；利用Autodock Tools 1.5.6軟件對小分子-蛋白進行分子對接，通過Pymol軟件對分子對接結果進行可視化分析，根據結合能（binding energy）對有效成分-靶點蛋白的對接效果進行評價，結合能小于0表示兩者可自發結合，結合能小于-5 kcal/moL者，說明小分子與蛋白結合性良好[6］。

2 結果

2.1 四逆散有效化合物篩選情況

通過TCMSP數據庫，可檢索出柴胡涉及349種化學成分，枳實涉及65種化學成分，白芍涉及85種化學成分，甘草涉及280種化學成分，以口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為標準，柴胡可篩選出17種活性成分，枳實可篩選出22種活性成分，白芍可篩選出13種活性成分，甘草篩選出92種活性成分，刪除4味中藥之間重復活性成分、刪除無對應靶點蛋白的活性成分，結果共得出133種活性成分，156個靶點蛋白，表1隨機展示4味中藥部分活性成分基本信息。

表1 四逆散部分活性成分

2.2 中藥-化合物-靶點網絡分析

利用UniProt數據庫將靶點蛋白注釋成基因名，共得到153個基因靶點，導入Cytoscape 軟件構建中藥-化合物-靶點網絡，該網絡中共有279個節點及2 356條邊，利用不同顏色及形狀區分中藥、活性成分等，網絡中每個節點發出的連線為其度值，度值越大表示該節點在網絡中的重要性越大，圖中度值越高者顏色越深面積越大，反之顏色淺且小，其中Degree值較大的有PTGS2、CALM、ESR1、HSP90AB1、AR等。

2.3 四逆散治療UC的作用靶點分析

根據人類基因數據庫GeneCards可檢索出潰瘍性結腸炎相關基因靶點共1 111個，利用生物信息學與進化基因組學平臺，對1 111個UC靶點及153個四逆散靶點進行交集，繪制Venn圖，可得出四逆散治療UC的作用靶點65個。將作用靶點導入STRING數據庫構建PPI蛋白網絡互作圖，圖中有65個節點、779條邊。其中，面積越大顏色越深表示Degree值越高，線條越粗表示節點與節點間作用強度大，排名靠前的關鍵靶點有TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、MAPK3等。

2.4 基因本體功能分析及KEGG通路富集分析

利用DAVID數據庫對65個作用靶點進行GO功能富集分析，結果BP分析314條、CC分析43條、MF分析63條，其中生物過程分析靶點集中在RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、細胞增殖的正調控、轉錄的正調控-DNA的模板、對藥物的反應、信號轉導等；細胞成分分析中靶點集中在細胞核、胞漿、細胞外空間、細胞質、質膜等；分子功能分析中靶點主要集中在蛋白質結合、蛋白質同聚活性、酶結合、相同的蛋白質結合、ATP結合等，分別取BP、CC、MF分析中前十者繪制柱狀圖。見圖1。KEGG信號通路分析中靶點主要富集在癌癥的路徑、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等，根據MEDIAN函數結果，取前28個通路繪制氣泡圖。見圖2。

圖1 GO分析柱狀圖

圖2 KEGG通路分析氣泡圖

2.5 靶點-通路-生物功能圖分析

將排名前28的信號通路、前10的生物過程及其富集的靶點導入Cytoscape軟件，構建靶點-生物過程-信號通路網絡。見圖3。該網絡共有101個節點，424條邊，墨綠色正八邊形代表28條信號通路，淺藍色正六邊形代表10個生物過程，淺粉色代表富集在信號通路、生物過程中的靶點，面積的大小、顏色的明暗變化代表其Degree值得高低。

圖3 靶點-生物功能-信號通路

2.6 分子對接情況

利用STRING數據庫及RCSB PDB數據庫檢索出6個關鍵靶點（TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、MAPK3）的蛋白結構，分別為2k8f、4cni、1mkk、5uui、5t01、6ges，利用AutoDock軟件對6個關鍵靶點及柴胡的17種活性成分進行分子對接，見表2，表格中所有數值均小于0，說明君藥活性成分與關鍵靶點可以自發結合，而VEGFA、TNF與君藥活性成分對接后結合能普遍小于-5kcal/mol,可見VEGFA、TNF與君藥活性成分結合性好，能形成穩定的結合；利用Pymol軟件對活性成分和關鍵靶點的對接結果進行可視化處理，主要選取每列結合性最佳者進行分析（在Pymol可視化處理過程中，如未能顯示氫鍵，考慮小分子與蛋白質之間是以其他相互作用力相結合，予展示以氫鍵結合的對接模式組）。見圖4。

表2 君藥活性成分--關鍵靶點對接結果

圖4 部分靶點蛋白與活性成分對接模式圖

3 討論

潰瘍性結腸炎作為炎癥性腸病（IBD）的一種，其病因目前尚未完全明確，目前研究認為是一種慢性自身免疫病[7］,主要由免疫反應介導并與遺傳和環境因素密切相關[8］，越來越多的研究認為機體免疫功能紊亂是引發UC的主要因素，細胞免疫因子的作用也越來越受重視[9］。在篩選出來的有效化合物中，根據其Degree值大小，可以得出槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）兩種有效化合物，槲皮素作為類黃酮化合物具有抗氧化和抗炎作用，對炎癥和免疫起調節作用，有研究表明槲皮素及其衍生物可以有效抑制結腸的炎癥損傷，機制可能是槲皮素具有抑制促炎性細胞因子和/或改變腸道菌群的能力[10-11］；山奈酚具有潛在的免疫調節作用，它可以保護腸黏膜免受DSS誘導的UC侵害[12］。

在PPI蛋白互作網絡圖中，根據Degree值可發現：細胞腫瘤抗原（TP53）、白介素-6（IL6）、血管內皮生長因子（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）、轉錄因子（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）等多個靶點可能在四逆散治療UC中起著重要作用。IL-6是一種促炎因子，主要參與炎癥免疫過程，研究發現UC患者機體炎癥黏膜中IL6水平與病情呈正相關，病情越重IL6水平越高[13］，阻斷IL6受體的信號傳導是非常有效治療的治療手段[14］。VEGFA是VEGF中的一種，可促進血管生成和內皮細胞增殖。而研究了證明VEGF在潰瘍性結腸炎患者的黏膜表達顯著升高[15］。動物實驗研究發現，中和抗VEGF抗體可通過減少過度的血管通透性和減少炎癥細胞浸潤，部分改善大鼠實驗性UC[16］。TNF是由T淋巴細胞和單核巨噬細胞產生的具有多種生物活性的促炎因子和免疫調節劑，與IL6被認為是能介導UC發病的細胞因子[17］。有研究發現，UC活動期患者體內TNF水平明顯高于緩解期組及健康組，可通過TNF水平評估患者病情[18］。MAPK3是MAPK家族成員之一，也可稱為ERK1，具有細胞的存活、增殖、分化和程序性死亡的多種功能。有實驗發現，UC模型組大鼠結腸黏膜中ERK1基因相對正常組表達量升高，研究者認為UC大鼠模型可能是通過激活ERK信號轉導途徑實現腸道損傷修復，ERK1可能為該途徑關鍵基因[19］。

從功能富集分析中可發現，四逆散關鍵靶點可能通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路發揮治療UC的作用。PI3K-Akt信號通路主要與細胞增殖和凋亡有關，研究發現PI3K/Akt信號轉導通路參與TNF-α等促炎細胞因子的調控和釋放，在UC的發展和進展中起著重要作用[20］。MAPK途徑在三級激酶級聯反應中發揮信號轉導功能,靶向MAPK信號傳導途徑被認為是用于管理腸道炎癥有吸引力的治療策略[21-22］。HIF-1是一種與缺氧應激相關的轉錄活性因子，參與調節細胞凋亡、細胞周期，它與PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等通路存在密切關系，能在免疫性疾病中發揮作用[23］。

在分子對接方面，關鍵靶點與柴胡活性成分均能自發結合，而靶點以VEGFA、TNF結合性最好，活性成分以八環素（Octalupine）、柴胡皂苷c（saikosaponin c_qt）、豆甾醇（Stigmasterol）、α-菠菜甾醇（α-spinasterol）結合性最好。研究發現柴胡提取物（例如柴胡皂苷c）具有明顯的抗炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤、神經調節活性和免疫調節，主要通過MAPK、NF-κB或其他途徑[24］。豆甾醇是一種具有確定的免疫調節特性的天然甾體醇，能減弱先天和適應性免疫應答[25］，具有潛在的抗炎作用，可以抑制促炎和基質降解介質[26］。α-菠菜甾醇是一種在多種植物中發現的類固醇化合物，具有抗炎、鎮痛、抗驚厥、抗氧化、抗抑郁的藥理作用[27］。

綜上，四逆散可能通過相關活性成分（如quercetin、kaempferol等）及相關靶點（如TP53、IL6、VEGFA等），參與調控RNA聚合酶II啟動子轉錄、細胞增殖、轉錄、信號轉導等生物過程及PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等信號通路，從而調節免疫功能、抑制炎性反應的發生，最終達到治療潰瘍性結腸炎的目的，體現了四逆散治療潰瘍性結腸炎具有多成分、多靶點、多通路的作用特點。目前四逆散治療UC的研究并不多，且以IL6、IL4/STAT信號通路、NF-κB信號通路等為主要研究對象，本研究通過網絡藥理學及分子對接的方法，為之后研究四逆散治療UC提供新的研究思路。