云芝多糖對腸道益生菌生長的影響

陳镕坤，池延添，易永旺，鄧柳鴻，曾亮，魏奇

1.寧德師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（寧德 352100）；2.福建省科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地（寧德 352100）

益生菌是腸道中的優(yōu)勢菌群。益生菌可以幫助消化食物，抑制腸道內(nèi)有害細菌的生長，從而維持腸道的微生態(tài)平衡[1-3]。青春雙歧桿菌是一種有益菌，存在于人體的腸道內(nèi)，具有預(yù)防便秘和恢復(fù)腸道菌群平衡等作用[4]。酪丁酸梭菌能夠促進腸道內(nèi)其他有益菌的生長，具有修復(fù)損傷的黏膜、抑制病原菌的生長和恢復(fù)腸道菌群平衡的作用[5]。嗜熱鏈球菌是酸奶制作的主要菌種之一，可以消化乳糖，對胃酸和膽鹽具有耐受性，能夠有效改善酸奶品質(zhì)和機體腸道微環(huán)境[6]。植物乳桿菌是食品中常用的乳酸菌之一，能夠大量產(chǎn)酸，已有研究表明植物乳桿菌具有免疫調(diào)節(jié)、抑制致病菌生長和維持腸道內(nèi)菌群平衡的作用[7]。由此可知，益生菌對保持腸道正常微生物菌群平衡具有重要意義。

云芝（Coriolus versicolor）是一種大型真菌，富含多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和多種無機鹽等物質(zhì)。云芝的藥用價值高，具有降血脂、抗腫瘤、抗衰老、免疫增強和保肝等功效[8-10]。柴新義等[11]研究發(fā)現(xiàn)，云芝多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黃曲霉菌具有抑制作用。王星光等[12]研究發(fā)現(xiàn)，云芝糖肽具有抗腫瘤的作用，其對抗腫瘤藥物具有增敏的作用。王康樂等[13]研究發(fā)現(xiàn)云芝多糖具有保肝作用，云芝多糖能夠降低酒精性肝損傷小鼠血清中總膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、甘油三酯和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平。

研究以云芝多糖為原料，探究云芝多糖對腸道益生菌生長的影響，并且評估云芝多糖對4種益生菌在體外模擬胃液和體外模擬腸液中的影響。該研究能夠為云芝多糖的進一步開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 主要材料與試劑

云芝多糖（上海源葉生物科技有限公司）；胰蛋白酶、胃蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）菌株（ATCC8014）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）菌株（ATCC14485）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）菌株（ATCC25755）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）菌株（ATCC15703）：廣東省微生物菌種保藏中心；TPY肉湯、TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基（不含瓊脂）、MC培養(yǎng)基、MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基、強化梭菌培養(yǎng)基、丁酸梭菌檢驗培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HFsafe1200LC生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；UPT-ⅠⅠ-20T實驗室超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；DHP-9272A電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海飛越實驗儀器有限公司）。

2 試驗方法

2.1 菌液的制備

分別取單環(huán)菌液（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至強化梭菌培養(yǎng)基、TPY肉湯、MC培養(yǎng)基（不含瓊脂）和MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代后得到相應(yīng)活化的菌株。每次試驗前，分別取100 μL上述4株菌液（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至不同的液體培養(yǎng)基。將接種后的菌液置于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h。

2.2 生長試驗

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至液體培養(yǎng)基中（CK）與添加2%云芝多糖的液體培養(yǎng)基。將接種后的樣品保存于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，按預(yù)設(shè)時間間隔取樣，以測定其生長濃度。樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗培養(yǎng)基平板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.3 體外胃腸模擬液的制備

采用0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.4）配制不同的液體培養(yǎng)基，用鹽酸將液體培養(yǎng)基的pH調(diào)至3，在121 ℃條件下高溫高壓處理15 min。分別取0.5 g胃蛋白酶加入100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中，即得體外模擬胃液。

采用0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.4）配制不同的液體培養(yǎng)基，用鹽酸將液體培養(yǎng)基的pH調(diào)至7，在121 ℃條件下高溫高壓處理15 min。分別取1 g胰蛋白酶加入100 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基中，即得體外模擬腸液。

2.4 云芝多糖對4種益生菌的影響試驗

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至液體培養(yǎng)基中（CK）與分別添加0.5%，1%和2%云芝多糖的液體培養(yǎng)基。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h，梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗培養(yǎng)基平板中，其中，TPY瓊脂培養(yǎng)基用于測定青春雙歧桿菌菌落數(shù)，MC培養(yǎng)基用于測定嗜熱鏈球菌菌落數(shù)，MRS培養(yǎng)基用于測定植物乳桿菌菌落數(shù)，丁酸梭菌檢驗培養(yǎng)基用于測定酪丁酸梭菌菌落數(shù)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.5 云芝多糖對益生菌在模擬胃液中的耐受性試驗

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至體外模擬胃液中（CK）與添加2%云芝多糖的體外模擬胃液。將接種后的樣品保存于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)0 h和3 h。樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗培養(yǎng)基平板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.6 云芝多糖對益生菌在模擬腸液中的耐受性試驗

在無菌條件下，分別取100 μL已活化的菌株（酪丁酸梭菌、青春雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌）接種至體外模擬腸液中（CK）與添加2%云芝多糖的體外模擬腸液。將接種后的樣品保存于厭氧培養(yǎng)罐中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)0 h和3 h。樣品經(jīng)梯度稀釋后，分別吸取0.1 mL稀釋液涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和丁酸梭菌檢驗培養(yǎng)基平板中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24 h后計數(shù)，單位為lg（CFU/g）。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，試驗的重復(fù)次數(shù)為3次，并且取3次重復(fù)試驗的平均值。顯著性分析采用SPSS 20軟件，P＜0.05表示具有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 云芝多糖含量對4種益生菌生長的影響

由圖1可知，2%的云芝多糖能夠顯著增加青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量（P＜0.05）。與CK組相比，隨著云芝多糖添加量的增加，青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量也隨之增加。與CK組相比，云芝多糖的添加量越高，酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量也越多。2%的云芝多糖能夠顯著增加酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量（P＜0.05）。云芝多糖添加量為2%時，植物乳桿菌的菌落數(shù)量與云芝多糖添加量為0.5%和1%的植物乳桿菌的菌落數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。云芝多糖不同的添加量（5%，1%和2%）的嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量與CK組沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 云芝多糖含量對四種益生菌生長的影響

3.2 4種益生菌的生長曲線

由圖2可知，當培養(yǎng)時間為0～7 h時，云芝多糖處理組中的酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量與CK組中酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量相近。當培養(yǎng)時間為12～24 h時，云芝多糖能夠增加酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量。由圖3可知，當培養(yǎng)時間為0～24 h時，云芝多糖處理組嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量與CK組的嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量相近，云芝多糖對嗜熱鏈球菌的菌落數(shù)量沒有顯著影響（P＞0.05）。由圖4可知，當培養(yǎng)時間為0～24 h時，云芝多糖處理組與CK組中植物乳桿菌的菌落數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。由圖5可知，當培養(yǎng)時間為0～1 h時，云芝多糖處理組中青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量與CK組的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量相近。與CK組相比，當培養(yǎng)時間為3～24 h時云芝多糖能夠增加青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量。

圖2 酪丁酸梭菌的生長曲線

圖3 嗜熱鏈球菌的生長曲線

圖4 植物乳桿菌的生長曲線

圖5 青春雙歧桿菌的生長曲線

3.3 云芝多糖對4種益生菌在模擬胃液中的影響

青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌在體外模擬胃液中耐受性結(jié)果如表1所示。在培養(yǎng)時間為0 h時，添加云芝多糖與未添加云芝多糖處理組的青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌的菌落數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05）。由此可知，初始接種的菌落數(shù)量相近。青春雙歧桿菌在未添加云芝多糖的模擬胃液中培養(yǎng)3 h后，其菌落數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。云芝多糖處理組的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量顯著高于未添加云芝多糖處理組的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量（P＜0.05），并且云芝多糖處理組中的青春雙歧桿菌的菌落數(shù)量與0 h沒有顯著差異（P＞0.05）。嗜熱鏈球菌在模擬胃液中培養(yǎng)3 h后未能檢測出。模擬胃液中添加云芝多糖對植物乳桿菌和酪丁酸梭菌的生長影響不大。由此可知，云芝多糖能夠增強青春雙歧桿菌對體外模擬胃液的耐受性，而對植物乳桿菌、嗜熱鏈菌和丁酸梭菌的改善作用不顯著（P＞0.05）。

表1 4種益生菌在云芝多糖的模擬胃液中的生長情況

3.4 云芝多糖對4種益生菌在模擬腸液中的影響

青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌在體外模擬腸液中耐受性結(jié)果如表2所示。青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌在模擬腸液中培養(yǎng)3 h，其菌落數(shù)量與0 h沒有顯著差異（P＞0.05）。模擬腸液中添加云芝多糖對青春雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌和酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量沒有顯著差異（P＞0.05）。由此可知，模擬腸液中添加云芝多糖對植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和丁酸梭菌的生長無明顯的促進作用。

表2 4種益生菌在云芝多糖的模擬腸液中的生長情況

4 結(jié)論

云芝多糖具有很高的藥用價值，已有研究表明云芝多糖具有保肝、抗氧化、抗腫瘤和增強免疫功能等功效[14-17]。云芝多糖可以作為腸道內(nèi)的益生菌的營養(yǎng)來源，并且能夠促進腸道內(nèi)益生菌的生長和繁殖。云芝多糖與益生菌結(jié)合后，可以提高益生菌的鹽耐性和酸耐性，在腸道微生物平衡中起到積極作用[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)云芝多糖能夠增加青春雙歧桿菌和酪丁酸梭菌的菌落數(shù)量。由此可知，云芝多糖可通過促進青春雙歧桿菌和酪丁酸梭菌的生長和繁殖，從而維持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡。通過模擬胃腸液試驗發(fā)現(xiàn)云芝多糖能夠增強青春雙歧桿菌在體外模擬胃液中的耐受性。此次研究能夠為云芝多糖相關(guān)功能性保健品和食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。當然，此次研究關(guān)于云芝多糖調(diào)節(jié)腸道微生物作用機制仍需要進一步的研究。