基于數據挖掘和網絡藥理學的中藥治療室性早搏用藥規律分析*

薛靜，瞿晶田，韓真真，孫瑜，孫精通

（1．天津中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，天津 300381；2．天津中醫藥大學附屬保康醫院藥劑科，天津 300381）

室性早搏（VPB），又稱為室性期前收縮，屬于一種比較常見的心律失常。目前西醫對于VPB的治療，多采用鉀通道阻滯劑、鈉通道阻滯劑、β受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑等4類常用的抗心律失常藥物，還可采取射頻消融手術治療[1]。中醫將VPB歸屬為“心悸”的范疇，認為病位主要在心，總結的病機特點主要為本虛標實。通過對古代醫籍文獻的研究和臨床實踐，不同醫家提出了許多治療方法，比如從心氣不足，心陽不振論治，也可從脾血不統，心陰不足之心脾論治，也有從痰濁水飲，血絡瘀阻論治等等[2-6]。VPB的中醫證型有多種，加之中醫注重個體化治療，這就導致臨床用藥繁雜多樣。因此，利用數據分析技術對中醫臨床治療VPB的用藥規律的提取整理十分必要，通過數據挖掘出有效的藥物配伍，以期更好的服務指導臨床實踐。

1 資料與方法

1.1 數據來源 進入中國知網（CNKI）的高級檢索界面，以主題關鍵詞為“室性早搏＋中醫＋臨床”，全文關鍵詞為“中藥”并且篇名中不含“進展”。時間選擇為1979年1月1日—2020年3月1日。共檢索到273篇文獻。

1.2 納入及排除標準 納入臨床病例文獻，排除實驗研究類，綜述類等文獻；納入病例中應有明確診斷為“室性早搏”并有“心悸”等中醫病名表述；納入有具體中藥的組方，排除加減方和重復處方；納入文獻明確表明中藥的臨床效果較好，排除中藥為輔的臨床治療。

1.3 數據處理 參照中國藥典2015年版[7]和中藥學[8]標準，將數據庫中的110味中藥的名稱、功效、性味歸經等規范化處理，對于中藥有別稱或簡稱的，進行統一名稱，如“云苓”統稱為“茯苓”，“焦三仙”規范錄入“焦山楂，焦神曲，焦麥芽”。有些中藥炮制后性味歸經有所改變，如“生甘草，炙甘草”則分別統計。

1.4 統計方法 將上述所有中藥統一錄入Excel 2010，建立數據庫。對納入的所有中藥品種進行分類排序分析，采用SPSSClementine12、SPSSS tatistics20數據處理軟件對中藥數據進行關聯規則、因子分析等統計學處理。

1.5 網絡藥理學分析 使用BATMAN-TCM系統預測關鍵中藥所含化學成分，并獲取對應靶點；把這些靶點與Genecard數據庫中檢索到的室性早搏相關靶點相映射并取交集，將其作為治療室性早搏的潛在作用靶點；將上述靶點上傳至DAVID 6．8數據庫進行KEGG通路和GO生物過程富集分析，利用 Cytoscape 3．2．1 構建成分-靶點-通路等多層次網絡圖，分析預測關鍵藥物發揮藥理作用主要成分、靶點以及重要的信號通路。

2 結果及分析

2.1 單味中藥使用情況 最終從篩選的273篇文獻資料中，納入符合數據篩選標準的文獻102篇，共102首中藥組方，含中藥110味，累積頻率965次，前20味中藥，累計頻次562次，占總頻率的53．20%。使用頻次最高的前3位中藥品種分別是炙甘草（49 次，48．04%）、酸棗仁（43次，42．16%）、丹參（42 次，41．18%）結果見表1。

表1 高頻中藥（頻次前20）統計分析Tab.1 Statistical analysis of high frequency traditional Chinese medicine（top 20 frequencies）

2.2 高頻中藥性味統計 參照《中國藥典》2015年版和《中藥學》標準分類，將20味高頻中藥的性味進行規范的分類統計。高頻中藥的藥性統計最高者為溫（6次，30．00%）；五味統計最高者為甘（13次，43．33%）。結果見圖1。

圖1 高頻中藥性味統計分析Fig.1 Statistical analysis of high frequency Chinese medicine flavor

2.3 高頻中藥歸經統計 依據《中國藥典》2015年版標準進行性味歸經的統計校對，累計統計頻率為64次。高頻中藥歸經統計最高者為心經（14次，22．88%）結果見圖2。

圖2 高頻中藥歸經統計分析Fig.2 Statistical analysis of meridian attribution of high frequency traditional Chinese medicine

2.4 高頻中藥功效統計 以《中藥學》為標準，對高頻中藥的功效進行統計分析，共有9類：使用最多的為補虛藥（7次，35%），結果見圖3。

圖3 高頻中藥功效統計分析Fig.3 Statistical analysis of efficacy of high frequency traditional Chinese medicine

2.5 高頻中藥關聯規則分析 使用SPSSClementine 12數據挖掘軟件對所選擇的高頻中藥（頻次前20）進行關聯規則分析，使用Apriori建模進一步統計分析不同的中藥之間關聯配伍關系[9-10]。將支持度設置為15%，置信度設置為80%，最大前項數設置為5，提升≥1等條件，挖掘高頻中藥中的潛在藥物組合，通過分析，共獲得核心藥物組合6組。具體結果見表2。高頻中藥之間的關聯性分析的網絡化展示見圖4。

表2 高頻中藥關聯規則統計分析Tab.2 Statistical analysis of association rules of high frequency traditional Chinese medicine

圖4 高頻中藥關聯規則的網絡化展示Fig.4 Network display of high frequency association rules of traditional Chinese medicine

數據里中藥之間關聯規則的支持度和置信度越高，說明這兩種或幾種藥物的聯系越大越緊密，這種藥物聯系的核心組合，能直接反映出中藥治療VPB的核心對藥，這對分析方劑配伍規律是十分有幫助的[11-12]。筆者提取了支持度大于15%的6組組合藥物，從結果可以看出，1組和4組提取出的核心藥對配伍是“當歸-黃芪-酸棗仁-炙甘草”，當歸甘溫質潤，長于補血，為補血圣藥，黃芪甘溫，為補氣要藥，兩者合用，氣血雙補，酸棗仁養心陰，益肝血而安神，配合補益心脾的炙甘草，4味藥組成藥對，主要針對氣血虧虛之驚悸不安有很好的治療作用；2組和3組提取出的核心藥對是“麥冬-生地黃”和“生地黃-炙甘草”，生地黃清熱滋陰涼血 有清有補，治陰虛血熱之心神煩亂，麥冬養陰生津，潤肺清心，炙甘草藥性微溫，增強了補益心脾的作用，“生地黃-麥冬-炙甘草”3藥形成藥對滋心陰，清心火，益心脾，這也是“炙甘草湯”中的核心藥物；5組提取出的是核心藥對“生龍骨-生牡蠣”，龍骨牡蠣重鎮安神，平肝鎮驚，是治療心神不寧等疾病的常用藥對；6組提取出的核心藥對為“酸棗仁-遠志-炙甘草”酸棗仁入心肝經，能養心陰，益肝血而安神，遠志性善宣泄通達，既能開心氣而寧心安神，又能通腎氣而強志不忘，為交通心腎，安神定志之佳品，加之補益心脾，調和藥性的炙甘草。3藥組成藥對，主要針對心悸怔忡，失眠多夢等癥狀而治療。

2.6 高頻中藥因子分析 藥物之間的關聯規則分析解釋的主要是藥物之間的聯系疏密程度歸類與展示，一定程度上能代表用藥組合的使用規律，但是并不能展示整體數據中貢獻最大的藥物組成[13-14]。因此，筆者利用SPSS Statistics 20統計軟件的因子分析工具，通過提取共性因子，將具有相同本質的變量歸入一個因子，并對各變量之間的關系進行分類，找出貢獻率最大的因子。在統計前完成KMO和Bartlett的球形度檢驗，KMO 值為 0．584＞0．5，Bartlett的球形度檢驗的近似卡方值為532．548，顯著性檢驗 0．000，P＜0．001 符合要求，可以進行因子分析。通過旋轉成分矩陣分析，參考碎石圖，提取了貢獻率排名前6的因子，累積方差貢獻率58．816%，對照6個因子中，貢獻率較大的中藥成分進行提取分析。高頻中藥旋轉成分矩陣中貢獻率較大的中藥組成及因子方差百分比見表3，高頻中藥旋轉空間成分分析見圖5。

表3 因子中高度相關的中藥組成Tab.3 Highly correlated traditional Chinese medicine composition among factors

圖5 高頻中藥旋轉空間成分圖Fig.5 Rotational spatial component map of high frequency traditional Chinese medicine

通過成分旋轉矩陣，發現因子1高度相關的中藥組成為“酸棗仁、當歸、甘松、黃芪”，該組成包含了關聯規則分析提取的編號1的中藥組合的全部品種，并加入了甘松，甘松味辛、甘，性溫，具有理氣止痛、開郁醒脾的作用。因子方差百分比可知，因子1貢獻率最高，可知該藥物組分為整體方劑數據中采用的最廣泛的治療思路，總結為氣血雙補，兼養心陰，益肝血而安神，同時加入理氣醒脾之甘松，使補而不滯；因子2高度相關的中藥組成為“炙甘草、桂枝、生地黃”，桂枝能溫經通陽，化氣行水，炙甘草溫陽益氣養心，加入了清熱滋陰涼血的生地黃，從因子2的用藥組成來看，總結治療思路為溫經通陽、益氣的同時，滋陰涼血也同樣重要；因子3高度相關的中藥組成為“生龍骨、生牡蠣”，龍骨牡蠣重鎮安神，平肝鎮驚，是治療心神不寧等疾病的常用藥對，其治療思路為鎮驚安神；因子4高度相關的中藥組成為“麥冬、五味子”，麥冬養陰生津，潤肺清心，五味子益氣生津，補腎寧心，該因子治療思路著重于滋陰，補腎寧心；因子5高度相關的中藥組成為“川芎、白芍”，川芎辛溫，功能活血行氣，可補肝之氣，為血中之氣藥，可疏通臟腑經絡之氣，調節氣血運行，白芍養肝血，斂肝陰，養肝之本，因此該因子治療思路主要為補肝氣，養肝血，疏肝氣，肝為心之母，此為子病求母之思路；因子6高度相關的中藥組成為“人參”，人參，甘，微溫，有健脾養心，安神益智，另有大補元氣之功。綜合6個因子的高度相關中藥組成分析，治療VPB的最普遍的中醫思路主要為氣血雙補，兼養心陰，同時注重溫經通陽益氣，適當佐以補肝疏肝活血之品，同時兼入理氣醒脾之藥，使之補而不滯。

2.7 關鍵藥物酸棗仁靶點預測和室性早搏相關靶點檢索 數據挖掘顯示，使用頻次最高的前3味中藥為“炙甘草、酸棗仁、丹參”，關聯分析中支持度最高的藥物為“當歸、黃芪、酸棗仁”，因子分析中貢獻度最高的藥物為“酸棗仁、當歸、甘松、黃芪”，通過以上數據綜合分析，提取出關鍵藥物“酸棗仁”進行網絡藥理學分析，在BATMAN-TCM數據庫（http：//bionet．ncpsb．org/batman-tcm/）中以“suan zao ren ”為關鍵詞，“Score cutoff”設置為 30，“Ad-justed P-value”設置為0．05，檢索出酸棗仁主要化合物21種，分別編號S1-S21，包括BetulinicAcid，Acetyljujuboside B，Sylvestrene，Jujuboside A1，Betulin 等，同時獲取這些化合物對應靶點131個[15]。以“ventricular premature beats”為關鍵詞，在Genecard數據庫（http：//www．genecards．org/）中檢索室性早搏的相關靶點，與BATMAN-TCM數據庫獲得的成分預測靶點相對比并取交集，共獲得酸棗仁治療室性早搏的共同靶點59個[16]。

2.8 GO功能富集和KEGG信號通路分析 采用DAVID 數據庫（https：//david．ncifcrf．gov/）進行基因本體（GO）的生物過程富集分析，以 P＜0．01 對相關靶基因進行篩選，納入前20個最重要的條目，其中包擴11個與生物過程（GOTERM_BP_DIRECT）相關條目，主要涉及腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路，正性血管收縮調節，心臟傳導調節心率等方面；4個與細胞組分（GOTERM_CC_DIRECT）相關條目，主要涉及質膜，控鉀通道復合體等；4個與分子功能（GOTERM_MF_DIRECT）相關條目，主要涉及降低鉀通道活性，類固醇物質結合等條目。將數據通過 http：//www．bioinformatics．com．cn/平臺進行可視化處理，結果見圖6。圖中圓點越大，表明通路富集到的基因數目越多，圓點的顏色越紅，表明P值越小。

圖6 GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis

通過 DAVID 數據庫（https：//david．ncifcrf．gov/）進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）的信號通路的富集分析，以P＜0．01對相關靶基因通路進行篩選，得到11條重要通路，包括神經活性配體-受體相互作用通路，鈣信號通路，cGMP-PKG信號通路，心肌細胞腎上腺素能信號轉導通路等。將數據通過http：//www．bioinformatics．com．cn/平臺對通路富集分析的結果進行可視化處理[17]。結果見圖7，圖中圓點越大，表明通路富集到的基因數目越多，圓點的顏色越紅，表明P值越小。

圖7 KEGG富集分析Fig.7 Enrichment analysis of KEGG

2.9 “成分-靶點-關鍵通路”可視化網絡的構建和分析 通過Cytoscape3．2．1軟件，將“酸棗仁所含活性成分（S1-S21）”“酸棗仁治療室性早搏的59個共同靶點”“KEGG富集分析的11條關鍵通路（P1-P11）”進行關聯分析，構建成分-靶點-關鍵通路結合的多層次網絡圖。采用Cytoscape中的NetworkAnalyzer功能對所有的網絡節點拓撲學特征進行分析，分析的特征值包括自由度、介數中心性及平均最短路徑長度等數據。以度值作為主要的評價指標[18]，度值越大，該節點的面積就越大，結果見圖8。

圖8 成分-靶點-通路網絡（圓形-活性成分，菱形-靶點，正方形-通路）Fig.8 Network of traditional Chinese medicine-components-targets-pathways（circular-active component，diamond-target，square-pathway）

從網絡圖中發現，酸棗仁中對于治療室性早搏重要的活性成分為Betulin、BetulinicAcid、Dauricine等，重要的基因靶點包括ATPA1，PTGS2，PTGS1，TYR，CYP3A4等。重要的信號通路為：神經活性配體-受體相互作用通路，鈣信號通路，cGMP-PKG信號通路，cAMP信號通路。表明酸棗仁可能主要通過這些通路來發揮治療室性早搏的作用。

3 討論

VPB可見于伴有心臟器質性病變的患者，也可見于正常人[19]。中醫藥治療VPB時注重辨證論治，從人體整體角度進行調節，探索了多種途徑對該病進行治療。VPB中醫歸于心悸的范疇，通過分析，其病機多錯綜復雜，歷史上各個醫家對VPB的認識也各有不同。通過對中醫治療VPB的文獻進行統計分析，初步篩選探討了其臨床用藥規律，以進一步挖掘潛在的治療VPB有效的中藥、藥對或組方。結果表明，中醫對于VPB的臨床治療以補虛藥、安神藥、清熱藥較為常用，多選擇藥性偏溫、平、微寒，藥味偏甘，歸心、肝、脾經的中藥。臨床用藥時可著重參考當歸、甘松、黃芪、酸棗仁、炙甘草、桂枝、生地黃、生龍骨、生牡蠣、麥冬、五味子、川芎、白芍、人參等中藥進行配伍使用。通過數據挖掘分析，提取了關鍵中藥“酸棗仁”并通過網絡藥理學方法分析酸棗仁治療VPB的潛在作用機制，結果發現酸棗仁治療VPB涉及多通路、多靶點。涉及到的重要通路有神經活性配體-受體相互作用通路，鈣信號通路，cGMP-PKG信號通路cAMP信號通路。重要的基因靶點包括 ATPA1，PTGS2，PTGS1，TYR，CYP3A4 等。已知的研究證實，早搏大鼠的L型鈣通道（LCCs）mRNA水平和Ca2+-ATP酶基因的表達水平下降，說明早搏的發生與鈣信號通路和Ca2+-ATP酶的表達關系密切[20]。此外，有研究顯示酸棗仁皂苷A具有明顯的鈣通道阻滯作用。鄧偉等[21]結果顯示，酸棗仁皂苷A對L型鈣通道電流（Ica-L），有明顯影響，且呈現濃度依賴關系，通過抑制L型鈣通道，降低心率失常的發生，緩解心率失常等心血管系統類疾病。Coben等[22]研究發現，有些抗生素是強力CYP3A4、CYP2C9抑制劑，可對心律產生明顯的影響，這與網絡藥理學預測的關鍵靶點也相吻合。

綜上所述，本研究采用數據挖掘結合網絡藥理學的相關方法對中藥治療VPB的用藥規律及關鍵藥物酸棗仁治療VPB的潛在作用機制進行了多角度的探析，預測的通路和靶點與已知文獻報道的酸棗仁治療VPB的作用基本吻合，體現了網絡藥理學預測分析的準確性，同時揭示了酸棗仁多成分、多靶點、多途徑作用的特點。由于數據庫的局限和信息收集的不完善以及化合物之間的相互作用的復雜性，故研究預測的結果具有一定的局限性，需要構建復雜網絡進行進一步實驗驗證。