燈盞花素調(diào)控Nrf2/Gpx4通路對MIRI模型心肌凋亡的影響及作用機制研究*

石露露，韓衛(wèi)南，王強，許寧寧

（張家口市第一醫(yī)院，張家口 075000）

臨床治療心肌梗死方法包括溶栓治療、冠狀動脈介入治療和支架置入術(shù)以恢復(fù)心肌血流[1]。然而，急性心肌梗死發(fā)作后的心臟再灌注通常導(dǎo)致心肌細胞損傷，這被稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI），是急性動脈閉塞和隨后的再疏通后的重要并發(fā)癥[2]。MIRI過程會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)引起心肌細胞損傷和凋亡。谷胱甘肽過氧化物酶4（Gpx4）是一種磷脂氫過氧化物酶起作用，其可以抑制細胞內(nèi)脂肪過氧化[3]。Gpx4的表達受到Nrf2的靶向調(diào)節(jié)，近年來有研究發(fā)現(xiàn)激活核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/Gpx4信號通路可以緩解MIRI引起的心肌細胞鐵死亡[4]，但是其在氧化應(yīng)激和細胞凋亡中的作用仍不明確。燈盞花素是一種來源于芹菜的黃酮類化合物[5]，最新研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素對大鼠肝MIRI具有保護作用[6]。本文主要基于Nrf2/Gpx4途徑探討燈盞花素對MIRI動物模型心肌細胞損傷和凋亡的調(diào)控機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與材料 SD大鼠（220～250 g，SPF級，上海克萊斯動物中心，中國）。小動物呼吸機（Inspira ASV，哈佛儀器公司，美國）。燈盞花素片（Z53020121，云南植物藥業(yè)）。超聲心動圖（GE公司，美國）。HE試劑（H8070，DH0050，北京 Solarbio公司，中國）。ELISA（S0086，S0131M）和 TUNEL（C1098）試劑盒（Neyotime公司，中國）。RNAspin Mini試劑盒（GE Healthcare，美國）。Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）。Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)（Santa公司，美國）。兔單克隆Gpx4一抗（ab125066）、兔多克隆Nrf2一抗（ab92946）和山羊抗兔 HRP-IgG二抗（ab205718，Abcam 公司，美國）。PVDF膜（JS0344，JSENB公司，中國香港）。ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）。

1.2 動物分組、建模和干預(yù) 45只大鼠隨機分為Sham組、MIRI組和MIRI+燈盞花素組，每組15只。MIRI的構(gòu)建方法簡要敘述如下：大鼠麻醉（1%戊巴比妥，40 mg/kg）后連接呼吸機，切開心臟正上方的肌肉打開心包，然后將左前降支冠狀動脈結(jié)扎，通過觀察心電圖（ECG）待ST抬高30min后取出結(jié)扎線。建模24 h后，MIRI+燈盞花素組使用燈盞花素灌胃，每次劑量按燈盞花素計算為200 mg/kg，每日1次，連續(xù)7 d。Sham組和MIRI組使用等量的溶劑灌胃作為對照。

首先腹腔注射1%戊巴比妥（劑量為40 mg/kg）使大鼠麻醉，將針電極皮下插入四肢，并使用心電圖通過四肢導(dǎo)線進行監(jiān)測。在第3和第4肋間隙開胸手術(shù)后，將大鼠插管并連接呼吸機（潮氣量：3 mL/kg，呼吸頻率：60～70 次/min）。在皮膚，淺筋膜和深筋膜上切開，暴露左胸腔并打開心包，然后使用6-0線結(jié)扎左前降支冠狀動脈，此時ECG改變，心臟表面立即由深紅色變?yōu)榘咨碾妶DST段抬高。保持結(jié)扎30 min；然后取出絲線進行再灌注。為了防止感染，大鼠在手術(shù)后肌肉注射了80萬單位的青霉素。Sham組的大鼠進行相同的暴露操作但不結(jié)扎。建模24 h后，MIRI+燈盞花素組使用燈盞花素灌胃，根據(jù)文獻報道[7]，每次劑量按燈盞花素計算為200 mg/kg，每日1次，連續(xù)7 d。Sham組和MIRI組使用等量的溶劑灌胃作為對照。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 心功能指標檢測 大鼠麻醉后（40 mg/kg的戊巴比妥，腹膜內(nèi)注射），通過14 MHz相控陣線性儀檢測左室收縮末期壓力（LVESP）和左室舒張末期壓力（LVEDP）大上升和下降速率（±dP/dt max）。

1.3.2 HE染色 梗死邊緣組織在室溫下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脫水（從低濃度到高濃度）后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的小鼠肌肉組織切成5 μm切片，并將這些切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10 min。用自來水洗滌1～2min后，將玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2 min后，將玻片放入曙紅中10 s。在乙醇（濃度分別為70%、90%、95%和100%，每個濃度處理5 min）中脫水后，將玻片置于二甲苯中2 min，重復(fù)此步驟一次。最后，用中性膠密封玻片。在倒置顯微鏡下觀察載玻片。

1.3.3 TUNEL染色 采用4%的聚甲醛固定梗死部位邊緣的心肌組織并用梯度乙醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為5 μm的組織玻片標本，根據(jù)試劑盒說明書加入TUNEL染色，洗滌后加入蘇木精復(fù)染。高倍鏡下隨機選擇5個視野觀察凋亡情況計算凋亡指數(shù)（=TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞核數(shù)目×100%）。

1.3.4 ELISA檢測 取血液樣本通過靜置（室溫，30 min）和離心（3 000 rpm，半徑 8 cm，20 min）分離并收集上層血清，根據(jù)說明書加入抗體和顯色劑，根據(jù)450 nm下檢測吸光度和標準曲線計算超氧化歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）濃度。

1.3.5 RT-qPCR檢測 使用RNAspin Mini試劑盒從組織中提取RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃/15 min；98℃/5 min。然后使用BestarTMqPCR預(yù)混液進行qPCR 實驗，條件如下：95℃/2 min，94℃/20 s，58℃20s，72℃/20s，40個循環(huán)，最后在 72℃下延伸 4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。GAPDH作為內(nèi)源參照，通過比較循環(huán)閾值評估梗死區(qū)域邊緣心肌組織中mRNA水平。

1.3.6 蛋白印跡法（Western blot）檢測 將心肌組織研磨后萃取總蛋白并檢測濃度。然后分別取總量為40 μg的總蛋白進行分離，分離條件為10%的聚丙烯酰胺凝膠、80～120 V、90 min。然后通過濕法進行轉(zhuǎn)膜，在100 mV下將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。將一抗稀釋500倍后分別加入膜中并在4℃下孵育過夜。洗滌后加入山羊抗兔HRP-IgG二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h。本次研究內(nèi)參為GAPDH，分析目標蛋白條帶相對于GAPDH的灰度值分析梗死區(qū)域邊緣心肌組織中蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析使用SPSS 19軟件。數(shù)據(jù)以均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素對MIRI大鼠心功能的影響 3組大鼠心功能指標比較差異顯著（P＜0．05）。MIRI組的LVESP、±dP/dt max顯著低于Sham組，而LVEDP顯著高于 Sham 組 （P＜0．05），MIRI+燈盞花素組的LVESP、±dP/dt max顯著高于 MIRI組，而 LVEDP 顯著低于 MIRI組（P＜0．05）。見表1。

表1 燈盞花素對MIRI大鼠心功能的影響Tab.1 Effect of breviscapine on cardiac function of AMI rats

2.2 燈盞花素對MIRI大鼠心肌組織損傷的影響 如圖1所示，紅色和藍色分別為細胞質(zhì)和細胞核。Sham組細胞質(zhì)染色均勻且細胞核染色清晰，心肌細胞排列有序。MIIR組細胞質(zhì)染色較輕，細胞質(zhì)大小不一，心肌細胞正常形態(tài)被破壞并出現(xiàn)細胞丟失。MIRI+燈盞花素組的心肌細胞染色基本正常，排列基本有序。

圖1 HE染色檢測燈盞花素對MIRI大鼠心肌組織損傷的影響Fig.1 HE staining to detect the effect of breviscapine on myocardial tissue damage in MIRI rats

2.3 燈盞花素對MIRI大鼠心肌細胞凋亡的影響 如圖2所示，藍色和棕色分別為所有細胞核和凋亡細胞的細胞核。3組的心肌細胞凋亡情況比較差異顯著（P＜0．05）。Sham 組的凋亡指數(shù)為（1．86±0．26）%，MIRI組的凋亡指數(shù)（24．62±2．89）%顯著高于 Sham組（1．86±0．26）%，P＜0．05，MIRI+燈盞花素組的凋亡指數(shù)（12．05±1．57）%顯著低于 MIRI組（P＜0．05）。

圖2 TUNEL染色檢測燈盞花素對MIRI大鼠心肌細胞凋亡的影響Fig.2 TUNEL staining to detect the effect of breviscapine on myocardial cell apoptosis in MIRI rats

2.4 燈盞花素對MIRI大鼠氧化應(yīng)激水平的影響 3組的氧化應(yīng)激水平比較差異顯著（P＜0．05）。MIRI組的 SOD（56．42±6．49）U/mL 顯著低于對照組，MDA（13．23±1．46）nmol/mL 顯著高于對照組（P＜0．05）。MIRI+燈盞花素組的 SOD（78．05±8．12）U/mL 顯著高于 MIRI組，MDA（8．74±0．95）nmol/mL 顯著低于MIRI組（P＜0．05），見圖3。

圖3 燈盞花素對MIRI大鼠氧化應(yīng)激水平的影響Fig.3 Effects of breviscapine on the level of oxidative stress in MIRI rats

2.5 燈盞花素對MIRI大鼠心肌組織Nrf2/Gpx4通路轉(zhuǎn)錄水平的影響 3組大鼠心肌組織Nrf2/Gpx4通路轉(zhuǎn)錄水平比較差異顯著（P＜0．05）。MIRI組的Nrf2（2．05±0．13）和 Gpx4（1．44±0．11）mRNA 水平顯著低于 Sham 組（P＜0．05），MIRI+燈盞花素組的 Nrf2（3．21±0．24）mRNA 和 Gpx4（3．36±0．27）mRNA 水平顯著高于 MIRI組（P＜0．05）。見圖4。

圖4 燈盞花素對MIRI大鼠Nrf2/Gpx4通路轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.4 Effects of Breviscapine on the transcription level of Nrf2/Gpx4 pathway in MIRI rats

2.6 燈盞花素對MIRI大鼠心肌組織Nrf2/Gpx4通路中蛋白表達水平的影響 3組大鼠心肌組織Nrf2/Gpx4通路中蛋白表達水平比較差異顯著（P＜0．05）。MIRI組的 Nrf2（1．27±0．09）和 Gpx4（0．93±0．08）蛋白水平顯著低于 Sham 組（P＜0．05），MIRI+燈盞花素組的 Nrf2（2．06±0．16）和 Gpx4（1．72±0．12）蛋白水平顯著高于 MIRI組（P＜0．05）。見圖5。

圖5 Western blot檢測燈盞花素對MIRI大鼠心肌組織Nrf2/Gpx4通路中蛋白表達水平的影響Fig.5 Western blot detection of the effect of breviscapine on the protein expression level of the Nrf2/Gpx4 pathway in the myocardial tissue of MIRI rats

3 討論

在心肌組織的缺血/再灌注過程中，心肌細胞會大量凋亡，而這會嚴重影響心功能甚至導(dǎo)致心臟纖維化，影響日常生活和生命安全[8]，但是目前臨床上暫時沒有緩解心肌MIRI的有效方法。

燈盞花素（其分子式為4，5，6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸）是一種來自于傳統(tǒng)中草藥燈盞花的黃酮類化合物，在臨床用于治療心血管疾病和腦血管損傷[9]。本次研究結(jié)果顯示燈盞花素可以有效的緩解MIRI引起的心肌組織損傷和細胞凋亡，并提高MIRI后的心臟收縮和射血功能。

為進一步分析燈盞花素緩解MIRI引起的心肌細胞凋亡的機制，筆者檢測了心肌組織中氧化應(yīng)激水平以及Nrf2/Gpx4通路表達水平。已知MIRI引起的繼發(fā)性過氧化損傷和ROS升高會引起心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷和線粒體途徑凋亡，而SOD和MDA分別是體內(nèi)主要的抗氧化和氧化應(yīng)激指標[10-11]。SOD和MDA的水平受到機體脂質(zhì)氧化水平的調(diào)控，Gpx4是關(guān)鍵的氧化調(diào)控蛋白，其可通過抑制細胞膜脂質(zhì)的過氧化抑制細胞死亡和凋亡[12]。Gpx4的轉(zhuǎn)錄水平受到Nrf2的調(diào)控，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Nrf2被激活后可進入細胞核激活包括Gpx4、SOD在內(nèi)的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[13]。研究已經(jīng)證實了激活Nrf2在緩解MIRI損傷和抑制凋亡中的關(guān)鍵作用[14]。本次研究結(jié)果顯示燈盞花素可以促進MIRI模型心肌組織中Nrf2和Gpx4轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平，提高SOD的水平并抑制MDA。有研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素可促進Nrf2信號通路并護肝細胞免受缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化損傷[15]。燈盞花素也可通過提高Nrf2 mRNA和蛋白的水平抑制脂質(zhì)過氧化[16]。此外，一項最新研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)燈盞花素可通過調(diào)節(jié)Nrf2信號通路在顱腦損傷后提供神經(jīng)保護作用[17]。這提示燈盞花素可通過促進Nrf2的表達提高Gpx4的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進而減輕脂質(zhì)過氧化水平緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而抑制MIRI引起的心肌細胞損傷和凋亡。

綜上所述，燈盞花素具有緩解MIRI模型大鼠心肌細胞凋亡的功能，并且其保護心功能的機制可能與促進Nrf2/Gpx4通路有關(guān)。但是關(guān)于燈盞花素對MIRI的影響以及調(diào)控Nrf2/Gpx4通路的機制仍需要進一步研究。