中藥復(fù)方制劑熄風(fēng)膠囊和卡馬西平聯(lián)合治療對匹羅卡品癲癇大鼠海馬電壓門控性鈉通道的影響*

路巖莉，房艷艷，李新民，孫丹，韓耀巍，陳祖明

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，天津 300381；2．國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381；3．山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院兒科，臨沂 276002）

神經(jīng)元電壓門控性鈉離子通道（VGSC）在腦神經(jīng)細(xì)胞動作電位的產(chǎn)生和傳播中起重要作用，其功能異常與癲癇的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[1]，如電流密度增加、穩(wěn)態(tài)激活和失活分別向負(fù)值和正值轉(zhuǎn)移、持續(xù)電流增強(qiáng)、失活恢復(fù)加快和快速失活延遲，從而使VGSC異常活化，導(dǎo)致癲癇發(fā)作。因此VGSC是多種抗癲癇發(fā)作藥物的作用靶點，如卡馬西平（CBZ）、奧卡西平（OXC）和拉莫三嗪（LEV）等[2]。中藥復(fù)方制劑熄風(fēng)膠囊是馬融教授根據(jù)“益腎填精、豁痰息風(fēng)”的治則研制而成，臨床研究證實治療癲癇有效[3]，而且與CBZ聯(lián)合應(yīng)用時療效優(yōu)于單藥治療，其機(jī)制之一可能是熄風(fēng)膠囊通過降低癲癇大鼠多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)[4]，從而提高CBZ在腦脊液的藥物濃度[5]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)減少VGSC表達(dá)，并抑制異常活化可能是熄風(fēng)膠囊抗癲癇作用機(jī)制之一[6]。因此鑒于熄風(fēng)膠囊和CBZ都可影響VGSC的電生理功能，本研究進(jìn)一步探討兩者聯(lián)合應(yīng)用對VGSC的影響。

1 材料和方法

1.1 動物 選擇110只雄性無特定病原體（SPF）級Sprague Dawley（SD）大鼠（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證為SCXK-軍2012-0004），體質(zhì)量（45±10）g。

1.2 主要藥品及儀器 熄風(fēng)膠囊（每粒0．33 g；成分主要包括紫河車、天麻、石菖蒲、僵蠶、全蝎、郁金、川芎、白金丸；天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院杏林藥廠，津Z0252）；卡馬西平片（商品名：得理多，每片0．2g，北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H11022279）；氯化鋰（每瓶100 g，美國Sigma-Aldrich公司，批號746460）、鹽酸匹羅卡品（每瓶5g，美國Sigma-Aldrich公司，批號066k1730）、BX43手動顯微鏡系統(tǒng)（奧林巴斯北京銷售服務(wù)有限公司）；雙通道EPC-10膜片鉗放大器（德國HEKA公司）。

1.3 實驗造模 將110只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組20只，其余90只用于建立癲癇模型。先后腹腔注射127 mg/kg氯化鋰和30 mg/kg匹羅卡品（先于2/3量，30 min后予剩余量），大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）1 h后，予地西泮控制發(fā)作以減少病死率。

根據(jù)Racine的6級癲癇行為嚴(yán)重程度標(biāo)準(zhǔn)[7]，合格致癇大鼠模型為出現(xiàn)Ⅳ級以上癇性發(fā)作，且停止發(fā)作后狀態(tài)良好者。模型大鼠在此后的觀察過程中均出現(xiàn)了反復(fù)自發(fā)性發(fā)作（SRS）。

1.4 實驗分組及處理 從造模成功的85只SD大鼠中隨機(jī)選取80只分為4組，各20只。熄風(fēng)膠囊治療組（熄風(fēng)組）：熄風(fēng)膠囊0．66 g藥粉溶于4 mL純凈水中；CBZ治療組（CBZ組）：CBZ 20 mg/kg溶于4mL純凈水中；熄風(fēng)膠囊+CBZ聯(lián)合治療組（熄卡組）：0．66 g藥粉和BZ 20 mg/kg溶于4 mL純凈水中；模型對照組和空白對照組：各4 mL生理鹽水。每日早8：00 和晚 8：00 各灌胃 1 次，每次 2 mL，共 60 d。

1.5 動物行為監(jiān)測 影像監(jiān)控系統(tǒng)于開始給藥后連續(xù)監(jiān)測60 d，記錄每組SRS次數(shù)，評定驚厥級別。每周統(tǒng)計分析1次。實驗結(jié)束時，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 免疫組化實驗 分離大鼠海馬組織并切片，脫蠟至水，磷酸緩沖液浸泡5 min；放入檸檬酸-檸檬酸鈉溶液中反應(yīng)；3%H2O2溫育10 min；山羊免疫正常血清溫育30 min。用兔多克隆一抗（1∶25）孵育切片。用羊抗兔二抗孵育切片，磷酸緩沖液洗滌切片。先后滴加光譜純試劑、二氨基聯(lián)苯胺顯色液顯色、蘇木精核復(fù)染。封片、拍照。采用Image-Pro Plus 6．0軟件分析和計算平均陽性光密度值（OD）。

1.7 全細(xì)胞膜片鉗記錄 分離實驗大鼠海馬組織并切片；加入蛋白酶消化；放入盛有氧飽和標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液的離心管內(nèi)，輕輕吹打，取上部細(xì)胞懸液加入灌注槽內(nèi)，待細(xì)胞貼壁于蓋玻片上，即進(jìn)行檢測，并記錄峰值電流、半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓、半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓和失活后恢復(fù)時間常數(shù)（采樣頻率10 kHz，濾波頻率 2．9 kHz）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 24統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。所有實驗數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用SNK檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠行為學(xué)觀察 氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型是目前比較理想的研究顳葉癲癇動物模型[8]，較好的模擬了癲癇發(fā)生和形成的全過程。本實驗觀察可見3期改變：1）急性期：大鼠出現(xiàn)Ⅳ級及以上發(fā)作，達(dá)到SE。本實驗造模成功率為94．4%。2）靜止期：SE后2 d到14 d，SRS較少后者沒有。3）慢性期：SE 后 15～60 d，可觀察到Ⅰ～Ⅲ級的 SRS，詳見表1。空白對照組未見SRS，熄風(fēng)組、熄卡組和CBZ組 SRS 次數(shù)均低于模型對照組（P＜0．01），提示治療有效；在各治療組間，熄卡組SRS次數(shù)明顯低于熄風(fēng)組和 CBZ 組（P＜0．01），提示聯(lián)合治療優(yōu)于單藥，CBZ組 SRS次數(shù)明顯低于熄風(fēng)組（P＜0．01），提示CBZ組療效優(yōu)于熄風(fēng)組。

表1 各組大鼠SRS次數(shù)（±s）Tab.1 SRS frequency of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠SRS次數(shù)（±s）Tab.1 SRS frequency of rats in each group（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0．01；與模型對照組比較，##P＜0．01；與熄風(fēng)組比較，△△P＜0．01。

組別 動物數(shù) SRS發(fā)作（次數(shù)）空白對照組 20 0模型對照組 20 29．60±2．69**熄風(fēng)組 20 17．07±2．40##熄卡組 20 9．67±1．11##△△CBZ 組 20 12．47±1．96##△△

2.2 免疫組織化法檢測大鼠海馬VGSC的表達(dá) 光鏡（×200）下觀察各組切片（見圖1），發(fā)現(xiàn)實驗各組海馬CA3可見棕黃色顆粒狀或者點狀VGSC免疫反應(yīng)物，而CA1區(qū)和DG區(qū)較少見。在CA3區(qū)，空白對照組可見神經(jīng)元細(xì)胞分布較密集、均勻，胞體多呈棱錐形，VGSC廣泛分布于胞核和胞漿；模型對照組可見神經(jīng)元棕黃色區(qū)域減少、變淡，分布不均，在神經(jīng)元變性、壞死部位棕黃色變淺、消失，而在周圍組織中棕黃色增強(qiáng)，提示出現(xiàn)VGSC上調(diào)。各治療組中，各治療組均可見少量神經(jīng)元變性、壞死，熄卡組神經(jīng)元變性、壞死數(shù)量模型少于熄風(fēng)組和CBZ組；相應(yīng)的VGSC在神經(jīng)元變性、壞死部位表達(dá)中，熄卡組多于熄風(fēng)組和CBZ組，而在周圍組織中VGSC上調(diào)現(xiàn)象熄卡組明顯少于熄風(fēng)組和CBZ組。

圖1 VGSC在大鼠海馬組織的分布（免疫組織化學(xué)染色，×200倍）Fig.1 Distribution of VGSC in rat hippocampus（immunohistochemical staining，×200 times）

表2可見，在CA3區(qū)，與空白對照組比較，模型對照組 VGSC 表達(dá)上調(diào)（P＜0．05）；各治療組較模型對照組 VGSC 表達(dá)均下調(diào)（P＜0．05），其中熄卡組明顯低于熄風(fēng)組和 CBZ 組（P＜0．05），而熄風(fēng)組和 CBZ組組間差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。VGSC在各組CA1區(qū)和DG區(qū)表達(dá)變化不明顯，與圖1相對應(yīng)。

表2 大鼠海馬組織VGSC的表達(dá)（±s）Tab.2 Expression of VGSC in rat hippocampus（±s）

表2 大鼠海馬組織VGSC的表達(dá)（±s）Tab.2 Expression of VGSC in rat hippocampus（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0．05；與模型對照組比較，#P＜0．05；與熄風(fēng)組比較，△P＜0．05；與熄卡組比較，▲P＜0．05。

組別 動物數(shù) CA1區(qū)（OD） CA3區(qū)（OD） DG區(qū)（OD）空白對照組 10 0．210±0．000 0．210±0．000 0．210±0．000模型對照組 10 0．202±0．008 0．235±0．018* 0．213±0．003熄風(fēng)組 10 0．210±0．001 0．212±0．002# 0．212±0．002熄卡組 10 0．217±0．002 0．152±0．019#△ 0．218±0．003 CBZ 組 10 0．218±0．004 0．215±0．003#▲ 0．217±0．005

2.3 實驗大鼠海馬神經(jīng)元VGSC功能電生理學(xué)檢測

2.3.1 峰值電流（nA） 由表3可見，各治療組的峰值電流較模型對照組顯著降低（P＜0．01），提示癲癇大鼠經(jīng)治療后鈉離子內(nèi)流減少。其中與熄風(fēng)組和CBZ組相比，熄卡組的鈉離子內(nèi)流減少更加明顯（P＜0．01），提示聯(lián)合治療優(yōu)于單藥治療，而熄風(fēng)組和CBZ 組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

表3 鈉通道功能電生理學(xué)檢測數(shù)據(jù)比較（±s）Tab.3 Comparison of electrophysiological detection data of sodium channel function（±s）

表3 鈉通道功能電生理學(xué)檢測數(shù)據(jù)比較（±s）Tab.3 Comparison of electrophysiological detection data of sodium channel function（±s）

注：與模型對照組比較，**P＜0．01；與熄風(fēng)組比較，##P＜0．01；與熄卡組比較，△△P＜0．01。

組別動物數(shù)峰值電流（nA）半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活V1/2（μV）半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活V1/2（μV）失活后恢復(fù)時間常數(shù)（τ）空白對照組 10 -229．06±26．01 -55．11±2．06 -51．41±0．80 1．86±0．21模型對照組 10 -319．70±28．24 -58．95±1．97 -48．10±2．05 1．36±0．15熄風(fēng)組 10 -225．13±31．70** -55．73±1．68** -53．09±1．87** 2．17±0．40**熄卡組 10 -183．17±8．96**## -55．18±1．70** -56．01±3．05**## 2．69±0．35**##CBZ 組 10 -243．74±32．05**△△ -55．24±1．61** -57．61±0．89**## 2．50±0．15**##

2.3.2 半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓V1/2（μV） 由表3可見，各治療組的 V1/2較模型對照組上升（P＜0．01），提示癲癇大鼠經(jīng)治療后其半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓V1/2上升。其中，熄風(fēng)組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓V1/2稍低于CBZ組，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。與熄風(fēng)組和 CBZ 組相比，熄卡組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓V1/2無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

2.3.3 半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2（μV）由表3可見，各治療組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2較模型對照組下降（P＜0．01），提示癲癇大鼠經(jīng)治療后其半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2下降。其中與熄風(fēng)組相比，熄卡組和CBZ組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓 V1/2下降（P＜0．01）；與 CBZ組相比，熄卡組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2稍高，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

2.3.4 失活后恢復(fù)時間常數(shù)（τ） 由表3可見，各治療組的 τ明顯延長，有顯著性差異（P＜0．01），提示癲癇大鼠經(jīng)治療后其τ明顯延長。其中與熄風(fēng)組相比，熄卡組和CBZ組的τ延長，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）；與CBZ組相比，熄卡組的τ無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。

3 討論

馬融教授認(rèn)為癲癇發(fā)作頻繁且病程較長者，其病機(jī)關(guān)鍵在于“腎精虧虛、痰瘀阻絡(luò)”，治宜“益腎填精、豁痰熄風(fēng)”[9]，因此組方熄風(fēng)膠囊，前期臨床和動物實驗研究[3]證實控制癲癇發(fā)作有效，而影響VGSC電生理功能可能是其作用機(jī)制之一[6]。VGSC開放引起的去極化內(nèi)向電流是動作電位產(chǎn)生和傳遞的基礎(chǔ)，當(dāng)癲癇發(fā)作使海馬神經(jīng)元細(xì)胞VGSC的表達(dá)或者功能發(fā)生變化時，出現(xiàn)癲癇反復(fù)發(fā)作[2]。此外，針對匹羅卡品癲癇模型的多項研究證實海馬神經(jīng)元VGSC對CBZ的敏感性下降[10]，可能是其產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一[1]，而減少抗癲癇發(fā)作藥物的耐藥是目前研究的熱點之一。因此，本研究根據(jù)既往研究發(fā)現(xiàn)熄風(fēng)膠囊與CBZ聯(lián)合應(yīng)用時療效優(yōu)于單藥治療，且都可影響VGSC的電生理功能，進(jìn)一步探討兩者的協(xié)同作用機(jī)制。

本實驗發(fā)現(xiàn)VGSC的表達(dá)變化主要發(fā)生在CA3區(qū)，其中模型對照組神經(jīng)元退變、壞死，VGSC染色減少甚至消失，而在周圍正常組織中染色增強(qiáng)，提示出現(xiàn)VGSC上調(diào)，且在總體上VGSC表達(dá)水平上調(diào)超過損失，這與神經(jīng)元再生導(dǎo)致海馬苔蘚纖維出芽（MFS）有關(guān)，后者導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增高，進(jìn)而出現(xiàn)癲癇反復(fù)發(fā)作[11]。治療組中熄卡組海馬神經(jīng)元損傷明顯輕于熄風(fēng)組和CBZ組，提示聯(lián)合治療優(yōu)于單藥治療，而VGSC的表達(dá)水平均下調(diào)，與前期研究證實熄風(fēng)膠囊和CBZ均可通過減輕海馬神經(jīng)元線粒體損傷和MFS相一致[12]；與神經(jīng)損傷相伴隨的VGSC在神經(jīng)元退變、壞死部位表達(dá)熄卡組多于熄風(fēng)組和CBZ組，提示在前者治療下病變區(qū)域VGSC存在較多，對治療更加敏感；而在變性、壞死的神經(jīng)元周圍的正常組織中VGSC上調(diào)現(xiàn)象熄卡組明顯少于熄風(fēng)組和CBZ組，提示在病變周圍神經(jīng)元再生導(dǎo)致VGSC上調(diào)現(xiàn)象與藥物的治療效果呈負(fù)相關(guān)；如表2，在總體VGSC表達(dá)水平上，熄卡組明顯低于熄風(fēng)組和CBZ組，提示前者正常VGSC存在較多，而新生VGSC較少，故療效優(yōu)于后兩者，提示正常VGSC較新生VGSC對抗癲癇藥物治療更敏感[2]。

本實驗檢測VGSC的電生理參數(shù)，發(fā)現(xiàn)治療組的峰值電流較模型對照組顯著下降，提示癲癇大鼠經(jīng)熄風(fēng)膠囊和/或CBZ治療后鈉離子內(nèi)流減少，從而達(dá)到控制驚厥的目的。其中熄風(fēng)膠囊和CBZ聯(lián)合治療優(yōu)于單藥治療，其原因可能為兩者的協(xié)同作用，或者主要是熄風(fēng)膠囊增強(qiáng)了VGSC對CBZ的藥物敏感性，這與熄風(fēng)膠囊降低癲癇大鼠多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布[5]及提高CBZ在腦脊液的藥物濃度[6]有關(guān)。

癲癇大鼠經(jīng)治療后其半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓V1/2上升，即癲癇激活閾值升高，不易被激活，從而達(dá)到控制驚厥的目的。其中與熄風(fēng)組和CBZ組相比，熄卡組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓V1/2有上升趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，提示對半數(shù)穩(wěn)態(tài)激活電壓V1/2的影響不是熄風(fēng)膠囊和CBZ聯(lián)合治療優(yōu)于單藥治療的主要藥理機(jī)制。癲癇大鼠經(jīng)熄風(fēng)膠囊和/或CBZ治療后其半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2下降，即癲癇失活閾值下降，較易失活，從而達(dá)到控制驚厥的目的。其中與熄風(fēng)組相比，熄卡組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2下降，有統(tǒng)計學(xué)意義；與CBZ組相比，熄卡組的半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2稍高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，提示對半數(shù)穩(wěn)態(tài)失活電壓V1/2的影響不是熄風(fēng)膠囊和CBZ聯(lián)合治療優(yōu)于單藥治療的主要藥理機(jī)制。總之，各治療組VGSC激活閾值上升、失活閾值下降，影響神經(jīng)元興奮性，從而達(dá)到控制癲癇的目的[2]，但是這不是熄風(fēng)膠囊和CBZ聯(lián)合治療優(yōu)于單藥治療的主要藥理機(jī)制。

癲癇大鼠經(jīng)治療失活后恢復(fù)時間常數(shù)明顯延長，不易被再次激活，從而抑制放電擴(kuò)散以控制驚厥[6]。其中與熄風(fēng)組相比，熄卡組的時間常數(shù)延長，有統(tǒng)計學(xué)意義；與CBZ組相比，熄卡組的時間常數(shù)有延長趨勢，無統(tǒng)計學(xué)意義，提示對失活后恢復(fù)時間常數(shù)的影響不是熄風(fēng)膠囊和CBZ聯(lián)合治療優(yōu)于單藥治療的主要藥理機(jī)制。

本研究進(jìn)一步證實熄風(fēng)膠囊和CBZ均可以減少神經(jīng)元壞死區(qū)域VGSC的損失和周圍正常組織VGSC的表達(dá)上調(diào)，影響VGSC的電生理功能，從而控制癲癇發(fā)作，其中減少VGSC峰值電流是主要作用機(jī)制。單藥治療時，CBZ在影響VGSC的電生理功能方面均強(qiáng)于熄風(fēng)膠囊，但無統(tǒng)計學(xué)意義；兩者聯(lián)合應(yīng)用療效明顯優(yōu)于單藥治療，主要作用機(jī)制為減少VGSC峰值電流。本研究在前期基礎(chǔ)上再次證實了中西藥聯(lián)合治療癲癇的合理性，為進(jìn)一步研究提供了理論基礎(chǔ)。