降糖消渴顆粒對糖尿病小鼠肝臟內質網應激及脂質代謝的影響*

張毅，趙丹丹，莫芳芳，高思華

（1．北京開放大學，北京 100081；2．北京中醫藥大學，北京 100029）

2型糖尿病（T2DM）是由于機體各靶器官對胰島素的敏感性下降，產生的一系列代謝綜合征，受遺傳、環境、飲食、壓力等多方面因素的影響[1]。肝臟是胰島素的靶器官之一，也是脂質代謝的重要場所，當機體對胰島素敏感性下降時，肝臟內可出現彌漫的脂肪變性，排除明確可致肝損害的誘因后，都可歸為非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）范疇[2]。T2DM患者因胰島素抵抗常伴有脂質代謝紊亂甚至出現NAFLD，這與肝細胞內質網在脂質代謝中發揮的作用密切相關[3]。在機體感受到影響蛋白折疊或脂質穩態的信號刺激時，一定程度的內質網應激可幫助細胞加速折疊未折疊蛋白、降解錯誤折疊的蛋白，從而維持內環境穩態。但長時間、持續的ERS會引發機體糖脂代謝紊亂、脂質異位沉積甚至細胞凋亡[4-6]。肝細胞富含內質網，ERS參與了NAFLD、肝硬化、病毒性肝炎等的過程，亦可加劇T2DM患者的脂質代謝紊亂和肝臟的脂肪變性[7]。由此可見，對于T2DM合并NAFLD的患者而言，調控內質網應激尤為重要。噻唑烷二酮類藥物是胰島素增敏劑，可增強外周組織對胰島素的敏感性，從而發揮降低血糖的效果。吡格列酮是臨床較常用于治療T2DM的噻唑烷二酮類藥物，吡格列酮除可降糖外，還具有糾正脂質代謝紊亂、抗炎等多種作用，也是臨床上用于治療NAFLD的常用藥物之一。

降糖消渴顆粒是以肝脾腎同調理論為指導，結合多年臨床經驗創制的中藥復方制劑[8-9]。前期實驗研究發現[10-12]，高脂飼料誘導成T2DM模型的KKAy小鼠，除血糖、血脂升高外，其肝臟HE染色均出現組織結構的改變及脂肪性空泡，表現出不同程度的脂肪變性，即出現了NAFLD。降糖消渴顆粒一方面可降低2型糖尿病KK-Ay小鼠空腹血糖水平、糖化血紅蛋白含量，提高葡萄糖耐量；另一方面還可減少血清和肝臟中三酰甘油、膽固醇、高/低密度脂蛋白的含量，改善肝臟組織結構，降低肝臟氧化應激、內質網應激的程度。但其改善脂質代謝，減輕NAFLD的機制是否通過調控內質網應激實現的，仍需進一步驗證。

本實驗選用高脂飼料誘導的T2DM（已出現NAFLD）KK-Ay小鼠為研究對象[10]，在前期研究的基礎上，進一步對肝臟中脂質代謝及內質網應激相關指標基因和蛋白的表達進行檢測，探討降糖消渴顆粒改善糖尿病小鼠肝臟脂質代謝的可能機制。

1 材料

1.1 動物及飼料 雄性8周齡KK-Ay小鼠、C57/6J小鼠，購自北京華阜康生物科技有限公司，審批號：SCXK（京）2012-0001。飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室，合格證號：SCXK（京）2011-0024。環境溫度維持在22～24℃，相對濕度維持在40%±10%，光照為12 h/12 h明暗周期。每日為動物提供充足的飼料和新鮮的飲用水，高脂飼料（20%蔗糖、2．5%膽固醇、10%豬油、1%膽酸鈉、66．5%基礎飼料）及普通飼料購于北京科澳協力飼料有限公司。飼養期間，實驗動物自由進食、飲水。

本動物實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會準許。

1.2 藥物 降糖消渴顆粒及制備方法詳見前期文獻[10-11]，規格：5．01 g生藥/g顆粒。吡格列酮片由北京太洋藥業有限公司生產。給藥藥品均保存于4℃條件下，用前去離子水配制成所需濃度混懸液，超聲30 min使其充分溶解。

1.3 主要試劑與儀器 光學顯微鏡（日本奧林帕斯）、Trizol試劑（美國 Invitrogen公司）、SYBR Mix試劑盒（美國ABI公司）、Step One PLUS熒光定量PCR儀器（美國ABI公司）、電動勻漿器（德國IKA儀器設備有限公司）、SAM超微紫外分光光度計[島津國際貿易（上海）有限公司]、半裙邊PCR板及封板膜（美國ABI公司）、PCR引物設計合成（上海生工生物工程有限公司）、10%中性緩沖液福爾馬林固定液（北京益利精細化學品有限公司）、兔抗peIF2α 抗體（CST）、兔抗 GRP78抗體（Abcam）、兔來源超敏免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）、小鼠來源超敏免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）、山羊血清工作液（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備 本實驗選取40只雄性KKAy小鼠誘導T2DM模型，8只雄性C57BL/6J小鼠作為正常對照組。所有小鼠適應性飼養1周后，給予KK-Ay小鼠高脂飼料飼養造模，期間C57BL/6J小鼠給予普通飼料。4周后，禁食不禁水12 h，檢測各組小鼠空腹血糖水平，以空腹血糖≥13．9 mmol/L為成模標準。經過4周高脂飼料誘導，本實驗中所有KK-Ay小鼠均成模。

2.2 分組及給藥方法 將成模后的小鼠按照體質量和空腹血糖水平隨機分為5組，分別為模型組，吡格列酮組，降糖消渴顆粒高、中、低（7，3．5，1．75 g/kg）劑量組，每組8只，其中中劑量由人鼠等效劑量換算得出，高、低劑量分別為人鼠等效劑量的2倍和0．5倍。中藥治療各組小鼠給予不同濃度（體積相等）降糖消渴顆粒混懸液灌胃，吡格列酮組實驗小鼠灌胃劑量計算如下：給藥劑量=6．5 mg/kg體質量×給藥體積（0．1 mL/10 g體質量），模型組和正常組予等體積蒸餾水灌胃。治療時長為10周，期間每日上午灌胃1次，實驗期間各組小鼠延續造模期間的飲食模式。

2.3 指標檢測

2.3.1 內質網應激相關指標基因檢測 治療周期結束后，麻醉實驗動物，開腹暴露肝臟并摘除，4℃預冷的生理鹽水清洗后分裝，液氮保存備用。剪取約100 mg肝組織，Trizol法提取肝組織總RNA，使用SAM紫外微量分光光度計檢測所提取RNA的純度及濃度。將提取的總 RNA 稀釋成 0．1 μg/μL，按照反轉錄試劑盒說明書建立20 μL反應體系，將總RNA反轉錄成cDNA，-20℃保存備用。進一步以SYBR Mix（10 μL）+c DNA 模板（2 μL）+上/下游引物（各1μL）+RNase free water（6 μL），反應總體積為20 μL的反應體系，使用熒光定量PCR儀進行擴增反應，反應條件如下：50℃，2min；95℃，10min；95℃，20 s；60℃，15 s，40個循環，結束后 4℃保存。每組取4個樣本，各樣本設2個復孔進行上樣，結果用相對定量分析，采用 2-ΔΔCT計算，ΔCT=Ct目的基因-Ctβactin，ΔΔCT=ΔCT 實驗組-ΔCT 正常組，RQ=（2-ΔΔCT）。引物序列見表1。

表1 內質網應激相關指標引物序列Tab.1 Primer sequence of endoplasmic reticulum stress related indexes

2.3.2 脂質代謝相關指標基因檢測 實驗操作及結果計算方法同2．3．1，引物序列見表2。

表2 脂質代謝相關指標引物序列Tab.2 Primer sequence of lipid metabolism related indexes

2.3.3 內質網應激相關指標蛋白檢測 肝組織切片依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中充分脫蠟，梯度濃度乙醇復水，去離子水沖洗干凈。在組織表面滴加30%過氧化氫溶液封閉組織內的內源性過氧化氫酶，然后加入適量抗原修復液修復，再加入10%山羊血清工作液封閉后，按照抗體說明書步驟，依次孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗。將新鮮配置、避光保存的DAB工作液滴加到玻片上的肝組織表面，電鏡下觀察，當組織表面呈現棕色后立刻終止反應，然后用蘇木素對肝細胞核進行染色。將載有肝組織的玻片依次浸入梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，干燥后鏡檢并拍攝圖片。

2.4 統計方法 實驗結果用SPSS 19．0軟件進行數據分析處理，計量資料以均值±標準差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0．05表示差異性具有統計學意義。使用Graph Pad Prism 6．0軟件繪制結果圖，使用Image Pro Plus軟件分析各組IOD/Area值的變化。

3 結果

3.1 降糖消渴顆粒對糖尿病小鼠肝臟IRE1α、XBP1基因表達的影響 糖尿病小鼠肝組織IRE1α、XBP1的 mRNA 表達較正常小鼠顯著上調（P＜0．01）。中劑量降糖消渴顆粒可下調IRE1α的mRNA表達（P＜0．05）。見表3。

表3 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟IRE1α、XBP1 mRNA 表達量的影響（±s）Tab.3 Effect of JTXKG and pioglitazone on the liver IRE1α，XBP1 mRNA expressions in mice（±s）

表3 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟IRE1α、XBP1 mRNA 表達量的影響（±s）Tab.3 Effect of JTXKG and pioglitazone on the liver IRE1α，XBP1 mRNA expressions in mice（±s）

注：與正常組比較，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 劑量（g/kg） 動物數 IRE1α XBP1 RQ（倍） RQ（倍）正常組 - 4 1．00±0．09 1．00±0．09模型組 - 4 4．42±1．33** 2．09±0．09**吡格列酮組 0．006 5 4 2．50±1．17 2．05±0．14降糖消渴顆粒高劑量組 7．00 4 1．97±0．96 1．45±0．39降糖消渴顆粒中劑量組 3．50 4 1．24±0．23# 1．97±0．13降糖消渴顆粒低劑量組 1．75 4 2．06±0．63 2．01±0．34

3.2 降糖消渴顆粒對T2DM小鼠肝臟SREBP-1c、SREBP2、Insig-1和FAS的mRNA表達的影響 糖尿病小鼠肝臟中SREBP-1c、SREBP2、Insig-1的mRNA表達較正常小鼠顯著上調（P＜0．01），FAS 也有所升高（P＜0．05）。吡格列酮體現出了良好的降低SREBP2（P＜0．01）和 Insig-1（P＜0．05）的基因表達量的作用。各濃度降糖消渴顆粒均下調了糖尿病小鼠肝臟SREBP-1c的 mRNA 表達（P＜0．01）。中、低劑量中藥還具有減少 SREBP2的 mRNA 表達（P＜0．01）和 FAS的 mRNA 表達（P＜0．05）的作用。除此之外，中劑量降糖消渴顆粒還可下調Insig-1的mRNA表達（P＜0．05）。見表4。

表4 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟SREBP-1c、SREBP2、Insig-1、FAS mRNA表達量的影響（±s）Tab.4 Effect of JTXKG and pioglitazone on the liver SREBP-1c，SREBP2，Insig-1 and FAS mRNA expressions in mice（±s）

表4 降糖消渴顆粒及吡格列酮對各組小鼠肝臟SREBP-1c、SREBP2、Insig-1、FAS mRNA表達量的影響（±s）Tab.4 Effect of JTXKG and pioglitazone on the liver SREBP-1c，SREBP2，Insig-1 and FAS mRNA expressions in mice（±s）

注：與正常組比較，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 劑量（g/kg） 動物數 SREBP-1c SREBP2 Insig-1 FAS RQ（倍） RQ（倍） RQ（倍） RQ（倍）正常組 - 4 1．01±0．16 1．00±0．10 1．01±0．16 1．02±0．25模型組 - 4 2．23±0．40** 2．15±0．17** 0．19±0．01** 1．75±0．33*吡格列酮組 0．006 5 4 1．93±0．54 1．18±0．12## 0．35±0．07# 1．49±0．50降糖消渴顆粒高劑量組 7．00 4 1．08±0．27## 2．10±0．38 0．27±0．05 1．34±0．28降糖消渴顆粒中劑量組 3．50 4 1．04±0．23## 1．43±0．30## 0．44±0．13# 1．08±0．18#降糖消渴顆粒低劑量組 1．75 4 1．02±0．12## 1．58±0．25## 0．27±0．09 1．07±0．08#

3.3 降糖消渴顆粒對糖尿病小鼠肝臟p-eIF2α、GRP78蛋白表達的影響 正常小鼠肝細胞內peIF2α（見圖1A）和 GRP78（見圖2A）的含量很少。糖尿病小鼠肝臟內出現大量棕色陽性顆粒，IOD/Area值較正常小鼠變化明顯（P＜0．01），eIF2α 磷酸化水平（見圖1B）和GRP78（見圖2B）含量顯著升高。經吡格列酮及各劑量降糖消渴顆粒治療后，肝臟內eIF2α的磷酸化水平（見圖1 C-F）和GRP78（見圖2 C-F）表達量都有不同程度的降低（P＜0．01），說明吡格列酮和降糖消渴顆粒均降低了肝臟內質網應激的水平，對肝臟起到一定的保護作用。

圖1 各組小鼠肝臟中p-eIF2α免疫組化結果（×40）Fig.1 Immunohistochemical results of p-eIF2α in liver of mice in each group（×40）

圖2 各組小鼠肝臟中GRP78免疫組化結果（×40）Fig.2 Immunohistochemical results of GRP78 in liver of mice in each group（×40）

圖3 各組小鼠肝臟中p-eIF2α、GRP78的IOD/Area值Fig.3 IOD/area value of p-eIF2α，GRP78 in liver of mice in each group

4 討論

降糖消渴顆粒[10-12]由生地黃、山萸肉、生曬人參、茯苓、丹參、黃連等10味藥按照一定的比例組成，是在“肝脾腎三臟同調，辨證治療2型糖尿病”學術思想指導下創立的系列復方之一，針對T2DM最常見的“肝脾腎氣陰兩虛，挾熱挾瘀”證型而設。肝主疏泄、脾主運化、腎主藏精，三臟協同作用，共同維持人體氣血津精等精微物質的生成、流通、敷布以及轉化，肝、脾、腎任何一臟失常，都會漸次波及其余兩臟，出現三臟同病的局面，最終導致糖尿病的發生[8]。中醫學中的水谷精微轉化過程與現代醫學中的糖脂代謝類似，肝脾腎三臟各司其職則精微物質得以正常轉化，相當于現代醫學的糖脂代謝平衡狀態。三臟同病，則痰濁、瘀血等病理產物叢生，相當于現代醫學的糖脂代謝紊亂狀態，異位沉積在肝臟中則導致NAFLD的發生。

肝臟在胰島素的作用下，通過維持循環和儲存脂質的動態平衡來調節機體的脂質代謝過程[13]。內質網應激的3條信號通路，由3種不同的跨膜蛋白介導，均可調控肝臟脂質含量。正常情況下，跨膜蛋白與分子伴侶GRP78結合處于失活狀態，當內質網應激發生后，GRP78與跨膜蛋白解離轉而與未折疊蛋白結合，因此，GRP78可作為內質網應激的標志物[14]。內質網應激信號通路之一的PERK-eIF2α通路可調控脂質生成和肝臟脂肪變性，參與了胰島素抵抗狀態下脂質在肝臟的異位沉積[15]。肝臟中的SREBP-1c可調節脂肪酸和三酰甘油的合成，SREBP2主要調控膽固醇的合成和攝取[16]。當SREBP-1c和SREBP2被激活時，與Insig1脫離，由內質網膜釋放，激活FAS，入核后增加脂肪酸、三酰甘油和膽固醇的合成[17]。在內質網應激狀態下，未折疊蛋白同樣可激活SREBPs生成更多的脂類供內質網膜利用以減輕應激環境下造成的膜損傷，緩解內質網應激[18]。

本實驗造模所用方法為高脂飼料喂養誘導2型糖尿病模型，前期實驗結果顯示[10]，實驗動物空腹血糖遠遠超出正常值且已出現了胰島素抵抗，肝臟也出現了明顯的脂肪變性。降糖消渴顆粒可改善高脂飲食誘導T2DM合并NAFLD小鼠糖脂代謝，減少肝臟脂肪含量，減輕肝臟脂肪變性程度及內質網應激反應。因此本實驗是在胰島素抵抗的狀態下進一步探索肝臟內影響脂質代謝的可能通路的，擬在此基礎上進一步探索降糖消渴顆粒改善T2DM合并NAFLD狀態下的肝臟內脂質代謝是否是通過調控肝細胞內質網應激實現的。

本實驗中，糖尿病小鼠肝臟中IRE1α、XBP1的mRNA表達較正常組均升高，p-eIF2α、GRP78的蛋白表達量顯著增加，提示糖尿病狀態下小鼠肝臟內質網應激的發生。通過對脂質代謝調節相關轉錄因子 SREBP-1c、SREBP2、Insig-1 及其下游 FAS 的mRNA表達量進行分析，發現由高脂飲食誘導的糖尿病小鼠肝臟中SREBP-1c和SREBP2的mRNA表達量均有所上調，反映糖尿病小鼠肝臟中脂質合成旺盛，這是肝臟脂質堆積，最終發展成為NAFLD的重要原因之一。結合肝臟內質網應激指標，提示糖尿病狀態下，肝臟內質網應激與脂質沉積具有一定的正相關性。經吡格列酮治療后，糖尿病小鼠肝組織中SREBP2的表達降低，Insig-1的表達升高，提示肝臟脂質合成作用有所減低；p-eIF2α、GRP78的蛋白表達量明顯下降，而IRE1α、XBP1的mRNA表達變化不明顯，除了進一步驗證了肝臟內質網應激與脂質合成具有相關性外，還提示吡格列酮可能通過內質網應激中的p-eIF2α通路起作用的。降糖消渴顆粒對肝臟脂質代謝紊亂和內質網應激反應的改善作用均較明顯，不僅中、低劑量組顯著降低了SREBP-1c和SREBP2的mRNA表達量，免疫組化結果也顯示各劑量組顯著降低肝臟內eIF2α的磷酸化水平，減少GRP78含量，減輕了肝組織內質網應激水平。因此推測降糖消渴顆粒可降低糖尿病狀態下肝臟內質網應激反應，減少脂質在肝臟中的過度合成的。

綜上所述，T2DM（合并NAFLD）KK-Ay小鼠肝臟的脂質合成作用與內質網應激反應具有相關性。低、中（1．75，3．5 g/kg）劑量降糖消渴顆粒可在一定程度上下調實驗小鼠肝臟中脂質代謝相關因子SREBPs的表達，以減少肝臟脂質的過度合成，同時減輕肝臟內質網應激反應，共同起到改善糖尿病肝臟脂質代謝紊亂的作用。