營養物質協同真菌修復石油烴污染土壤

吳燕紅，李 聰，龍海波，劉 超，石 冀，高煥方

（1. 重慶理工大學 化學化工學院，重慶 400054；2. 重慶匯亞環保工程有限公司，重慶 400041；3. 瀘縣應急管理局，四川 瀘州 646199； 4. 四川實樸檢測技術服務有限公司，四川 成都 610000）

機油由于運輸、使用或儲存不當，有時會漫流地面，作為污染物進入環境中［1-2］。機油中含有80%～90%（w）的總石油烴（TPH）［3］，TPH具有致癌、致突變性［4-6］，會破壞生態系統并威脅人類健康［7-8］，且TPH在土壤中具有頑固性和持久性［9-10］，很難將其從環境中去除。目前，我國有大量的石油烴污染土壤未得到合理處置［11］，因此探究一種綠色的有效去除土壤中石油烴的技術尤為必要。

生物修復是指通過酵母菌、真菌、細菌等微生物的作用去除土壤和地下水中的污染物，或使污染物無害化的過程［12］。生物修復技術具有可持續性、環境友好等優點，已成為當前的研究熱點［13-17］。生物刺激能促進可降解烴類菌株的生長，生物強化是加入預先馴化的菌株［18］。單獨使用生物刺激或生物強化均能提高環境污染物的生物降解率；聯合使用時，碳氫化合物的生物降解效果更好、更快［19-20］。從石油污染土壤中分離出的真菌菌株具有一定的降解石油烴的能力［21-23］，但用其修復石油烴污染土壤時，降解率較低［24-25］。WU等［26］分別采用生物強化、生物刺激修復TPH污染土壤，TPH去除率分別為17.5%和30%。而兩者協同修復以及可利用營養物質方面的研究報道較少［27］。

本研究將生物刺激與生物強化相結合，探究不同種類營養物質增強真菌雜色曲霉（Aspergillus versicolor）與土著菌株對機油污染土壤中TPH的去除效果，以此篩選最優營養物質，考察生物修復對土壤理化性質、土壤呼吸強度等的影響，以期為TPH污染土壤的生物修復提供參考。

1 實驗部分

1.1 土壤試樣及菌液

實驗所用土壤為某場地潔凈土，自然風干一周，研磨，過8目篩，采用40#機油配制成機油含量為7 000 mg/kg的土壤試樣，加入一定量的石油醚，攪拌，室外自然風干一個月，放陰涼處老化保存。供試土壤TPH含量5 225 mg/kg，pH 6.52，含水率（w）5.68%，含有機質 （w）1.73%。實驗所用菌液為真菌Aspergillus versicolor，由重慶某石油烴污染場地土壤中分離，斜面保存。

1.2 材料、試劑及儀器

淀粉、乳糖、牛肉膏、蛋白胨等購自北京奧博星生物技術有限責任公司；蔗糖、草酸、蘋果酸、碳酸鈉、碳酸鈣、磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈣、磷酸二氫銨、硫酸亞鐵、尿素、氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、無水硫酸鈉、酒石酸等均為分析純。

雷磁PHS-3E型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；GC-2014型氣相色譜儀（島津公司）； Gemini 300型掃描電子顯微鏡（德國卡爾-蔡司股份公司）；SEP-100型生化培養箱（上海精其儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 優勢營養物質的篩選

在100 g土壤試樣中加入20 mL菌液，分別加入質量分數8%的C源（淀粉、乳糖、蔗糖、草酸、蘋果酸、酒石酸、碳酸鈉或碳酸鈣）或質量分數4%的無機鹽（磷酸二氫鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈣、硫酸亞鐵、無水硫酸鈉、硫酸銅或磷酸二氫銨）或質量分數4%的N源（氯化銨、硝酸鈉、硝酸鉀、尿素、牛肉膏或蛋白胨），測定30 d后土壤試樣中TPH含量，計算TPH降解率，篩選出可刺激菌株降解作用的優勢營養物質。

1.3.2 優勢營養物質的降解效果評價

在100 g土壤試樣中加入20 mL菌液，加入一定量的優勢營養物質，比較修復15 d和30 d后土壤中TPH降解率及土壤pH變化、CO2釋放量。

1.4 分析表征

采用電位法測定土壤pH［28］；采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定土壤有機質質量分數［29］；采用氣相色譜法測定土壤試樣中TPH的含量［30］。采用SEM觀測土壤表面的形貌。

2 結果與討論

2.1 優勢營養物質的確定

不同C源、無機鹽及N源作為營養物質刺激菌株修復30 d，土壤中TPH的降解率見圖1。綜合不同C源、N源、無機鹽對土壤菌株的促進作用，以及N源、無機鹽過剩會對微生物產生毒害作用抑制其降解的特性，因此選取C源加入質量分數8%，N源、無機鹽加入質量分數4%［31］。由圖1可見，相比于其他C源、N源或無機鹽，加入C源蔗糖和酒石酸時，土壤中TPH降解效果較佳；加入N源TPH降解效果總體比加入無機鹽時更差。可以推測，真菌Aspergillus versicolor、污染土壤土著菌直接以石油烴為C源時菌株生長活性低，需要外加C源作為生長媒介。

圖1 不同營養物質刺激菌株對土壤中TPH的降解效果

2.2 兩種優勢C源添加量的優化

蔗糖和酒石酸添加量對土壤試樣中TPH降解率的影響見圖2。由圖2可見：隨著蔗糖及酒石酸添加量的增多，TPH降解率均逐漸升高；蔗糖添加量為10%（w，下同）、修復30 d時，TPH降解率達55.63%；酒石酸添加量為7%、修復30 d，TPH降解率為42.9%；繼續增加酒石酸添加量，TPH降解率略降低。

圖2 蔗糖和酒石酸添加量對土壤試樣中TPH降解率的影響

圖2表明：添加一定量的蔗糖刺激菌株生長，生物修復土壤中TPH降解效果隨時間變化的影響相對較小；而添加酒石酸的30 d修復效果明顯優于15 d。因為蔗糖屬于雙糖，其部分成分能被菌株快速吸收，營養物質消耗快且多，還有部分成分到后期較難被微生物所利用。酒石酸屬于可食用有機酸，酸性較強，加入土壤中會明顯改變土壤的pH，而支持真菌生長最適pH范圍為4.0～6.0，范圍之外會影響真菌生長或真菌需要一定的時間去適應土壤環境，故添加酒石酸的TPH降解效果在15 d時遠低于添加蔗糖。

2.3 兩種優勢C源添加對土壤pH的影響

微生物對營養物質的吸收、胞內酶的產生及活性受pH影響較復雜［32］，石油烴污染土壤pH也會隨微生物對烴類物質的吸收轉化而變化。蔗糖和酒石酸添加對土壤pH的影響見圖3。本實驗土壤試樣的初始pH為6.52，添加蔗糖修復15 d后土壤pH降至4.25～4.65，30 d后土壤pH在4.30～4.34范圍內相對穩定，隨修復時間增加變化不明顯。添加酒石酸修復15 d后土壤pH降至2.14～3.91，波動范圍較大；修復30 d后，土壤pH均略有提高，維持在2.35～4.41。可見，添加蔗糖和酒石酸修復后土壤pH均變化較大，總體呈下降趨勢，這與VAN BEILEN等［33］的研究結果相符。

圖3 蔗糖和酒石酸添加對土壤pH的影響

2.4 兩種優勢C源修復后土壤的呼吸作用

土壤呼吸作用釋放的CO2量主要與微生物、酶活性以及石油烴污染土壤中易受微生物分解轉化的碳組分有關［34-35］。土壤試樣經菌液及蔗糖、酒石酸生物修復前后的CO2釋放量見圖4。由圖4可知，未加菌液和C源處理的污染土壤在15 d和30 d時，CO2釋放量分別為22.28 mL/kg和31.83 mL/kg。

圖4 土壤試樣經菌液及蔗糖、酒石酸生物修復前后的CO2釋放量

添加菌液和蔗糖修復15 d后，CO2釋放量為44.57～142.61 mL/kg；修復30 d后CO2釋放量均有所增加，但隨著蔗糖添加量的增加，CO2釋放量逐漸下降。添加菌液和酒石酸修復15 d后，CO2釋放量最高僅有26.46 mL/kg；修復30 d后CO2釋放量呈倍數增長，最高達69.0 mL/kg。

對比發現，經蔗糖及酒石酸修復處理后土壤的CO2釋放量均增大。土壤中TPH降解速率與土壤呼吸作用強度有一定關系，蔗糖修復前期土壤呼吸強度迅速增強，到后期較緩；而酒石酸修復前期土壤呼吸強度幾乎沒有增強，而在后期迅速增強。

2.5 土壤形貌的SEM表征結果

未受污染土壤、TPH污染土壤以及添加菌液和質量分數10%的蔗糖修復30 d后土壤的SEM照片見圖5。由圖5可見：TPH污染土壤被原油覆蓋［36］，土壤顆粒緊致密實，土壤顆粒之間孔隙被堵塞，會降低土壤滲透性，使得土壤中微生物呼吸作用較弱、活性低，很難進行有效自然降解，土著菌也幾乎無法發揮作用；Aspergillus versicolor及蔗糖修復后土壤孔隙結構明顯增大，表面粗糙、疏松，呼吸作用增強，能有效去除TPH。

圖5 未受污染土壤（a）、TPH污染土壤（b）及添加菌液和蔗糖修復30 d后土壤（c）的SEM照片

3 結論

a）向石油烴污染土壤中添加真菌Aspergillus versicolor，再分別添加不同C源、無機鹽及N源作為營養物質生物刺激，對比發現，加入C源蔗糖和酒石酸時，土壤中TPH降解效果較佳。

b）蔗糖添加量為10%、修復30 d時，TPH降解率達55.63%；酒石酸添加量為7%、修復30 d，TPH降解率為42.9%；繼續增加酒石酸添加量，TPH降解率略降低。

c）添加蔗糖和酒石酸修復后土壤pH均呈下降趨勢。經蔗糖及酒石酸修復處理后土壤CO2釋放量均增大。蔗糖修復前期土壤呼吸強度迅速增強，到后期較緩；而酒石酸修復前期土壤呼吸強度幾乎沒有增強，而在后期迅速增強。

d）TPH污染土壤顆粒緊致密實，土壤顆粒之間孔隙被堵塞；經生物修復后土壤孔隙結構明顯增大，表面粗糙、疏松，呼吸作用增強，能有效去除TPH。