基于AKT信號通路探討替吉奧對大腸癌細胞株增殖、遷移和侵襲的影響

賀連棟 薛興翠 王鑫

(青海紅十字醫院，青海 西寧 810000)

大腸癌包括結腸癌和直腸癌，是人類常見惡性腫瘤之一，在全球男性、女性惡性腫瘤中分別居第3位和第2位，全球每年新發病例約800萬人，主要集中于40～50歲人群〔1,2〕。據統計，2017年美國癌癥發病例數、死亡例數分別為168.878萬、60.092萬，其中大腸癌發病例數、死亡例數分別為13.543萬、5.026萬〔3〕。2015年中國癌癥發病例數、死亡例數分別為429.2萬、281.4萬，其中大腸癌發病例數、死亡例數分別為37.63萬、19.10萬，發病率、死亡率均高于世界平均水平，且呈上升趨勢〔4,5〕。目前臨床常規治療大腸癌手段包括切除原發腫瘤、化療后放療和手術后的免疫治療，但效果并不盡如人意，術后復發、轉移患者約占62.4%〔6〕。大腸癌患者的5年生存率不足60%，術后轉移是影響生存期的重要因素，是導致大腸癌患者死亡的主要原因〔7,8〕。替吉奧是新型抗癌藥物，臨床上其治療胃癌安全有效，可降低胃癌細胞增殖、侵襲能力，促進凋亡〔9〕。蛋白激酶B(AKT)通路是癌細胞侵襲、遷移過程中重要信號轉導途徑〔10〕。但目前替吉奧對大腸癌的影響尚不明確。本研究將基于AKT信號通路探討替吉奧對大腸癌細胞株HT-29增殖、遷移和侵襲的影響，為大腸癌臨床治療提供一定理論價值。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 大腸癌細胞株HT-29細胞、胎牛血清、基質膠、蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抗體、磷酸化(p)-PI3K抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、增殖細胞核抗原(PCNA)抗體、基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(貨號：SCC-110711、S9030、354234、BC3640、PT0001、bs-0128R-2、bs-5538R-2、bs-5194R-2、bs-0115R-2、K101310P、K002290P、M1000110、SR134)購自上海恒斐生物科技有限公司；替吉奧(國藥準字：H20080802)購自山東新時代制藥有限公司；RPMI1640培養基、胰蛋白酶、化學發光試劑盒(貨號：ZY-3291R、ZY-B4637、ZY-11256)購自上海澤葉生物科技有限公司；青霉素、鏈霉素(貨號：PPSJ-100247、PPSJ-100309)購自廈門慧嘉生物科技有限公司；CCK-8試劑、結晶紫染液(貨號：QN1293-OIR、GL0942-PYK)購自北京百奧萊博科技有限公司；Transwell小室(貨號：354480)購自上海研卉生物科技有限公司；培養箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；全自動酶標儀(型號：ELX800)購自BIO-TEK公司；顯微鏡(型號：CX31)購自日本Olympus公司；化學發光成像系統(型號：ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養與分組 將HT-29細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI1640培養基中，于37℃、5% CO2培養箱中進行培養，待HT-29細胞進入對數期時，用胰蛋白酶消化，制備成1×105個/ml的單細胞懸液，接種于6孔板中，每孔100 μl。待細胞融合率達到70%～80%時，分為：對照組(HT-29細胞)；20 μg/ml替吉奧組(HT-29細胞+20 μg/ml替吉奧)；50 μg/ml替吉奧組(HT-29細胞+50 μg/ml替吉奧)；100 μg/ml替吉奧組(HT-29細胞+100 μg/ml替吉奧)。

1.2.2CCK-8法檢測各組HT-29細胞增殖情況 培養1.2.1中各組HT-29細胞，分別于培養24 h、48 h、72 h后加入CCK-8試劑，繼續培養2 h，用全自動酶標儀(450 nm波長)檢測各孔吸光度值(OD)。

1.2.3Transwell法檢測各組HT-29細胞遷移情況 用無血清培養液制備1×105個/ml HT-29細胞懸液，按1.2.1中分組處理，分別向Transwell小室上層加入200 μl，下室中均加入500 μl含10%胎牛血清的培養液，置于37℃、5% CO2培養箱中孵育24 h，擦去小室膜上未穿膜的細胞，用4%多聚甲醛固定下層遷移細胞，10 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用0.5%結晶紫染液染色，20 min后PBS洗滌。在倒置顯微鏡下觀察拍照，隨機選取200倍鏡下的6個視野，統計遷移細胞數。

1.2.4Transwell法檢測各組HT-29細胞侵襲情況 用無血清培養基稀釋基質膠(1∶8)，并向每個Transwell小室中加入50 μl，37℃放置1 h凝固。后續操作均與1.2.3中檢測細胞遷移情況步驟相同，選6個視野統計侵襲細胞數。

1.2.5Western印跡法檢測各組HT-29細胞中AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表達情況 培養1.2.1中各組HT-29細胞，48 h后收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與等量的上樣緩沖液混合均勻，100℃變性5 min，依次進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉膜、封閉，加一抗(1∶500稀釋的AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9抗體與1∶1 000稀釋的GAPDH抗體)4℃孵育過夜，TBST洗滌后加二抗(1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG)室溫避光孵育1 h，TBST洗膜，使用化學發光顯影試劑盒進行顯影，Tanon 600圖像分析系統掃描灰度值，以GAPDH為內參，分析AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9表達水平。

1.3統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1替吉奧對HT-29細胞增殖的影響 隨著時間延長，各組HT-29細胞OD450值均顯著升高(均P<0.05)。在24 h、48 h、72 h時，20、50、100 μg/ml替吉奧組HT-29細胞OD450值均顯著低于對照組(均P<0.05)，且隨著替吉奧濃度升高，HT-29細胞OD450值依次降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2替吉奧對HT-29細胞遷移的影響 與對照組相比，20、50、100 μg/ml替吉奧組HT-29細胞遷移細胞數均顯著降低(P<0.05)；隨著替吉奧濃度升高，HT-29細胞遷移細胞數依次降低，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖1。

2.3替吉奧對HT-29細胞侵襲的影響 與對照組相比，20、50、100 μg/ml替吉奧組HT-29細胞侵襲細胞數均顯著降低(P<0.05)；隨著替吉奧濃度升高，HT-29細胞侵襲細胞數依次降低，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖2。

2.4替吉奧對HT-29細胞中AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表達的影響 與對照組相比，20、50、100 μg/ml替吉奧組HT-29細胞中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；隨著替吉奧濃度升高，HT-29細胞中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表達水平依次降低，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2、圖3。

表1 各組HT-29細胞OD450值比較

表2 各組HT-29細胞遷移、侵襲細胞數及AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表達比較

圖1 各組HT-29細胞遷移情況(結晶紫染色，×200)

圖2 各組HT-29細胞侵襲情況(結晶紫染色，×200)

圖3 各組HT-29細胞中AKT、p-AKT、 PI3K、p-PI3K、PCNA、MMP-9蛋白表達情況

3 討 論

大腸癌作為消化系統常見的惡性腫瘤，發病率、死亡率較高，嚴重威脅人類的生命健康。大腸癌發病隱匿，早期癥狀不明顯，大部分患者確診時往往已處于晚期，采取手術、化療治療的療效并不顯著〔11〕。目前用于治療大腸癌的化療藥物大多通過競爭性抑制核苷酸合成、細胞毒作用殺死腫瘤細胞，常引起嘔吐、骨髓抑制、耐藥性等副作用〔12〕。替吉奧是一種新型抗癌藥物，屬于氟尿嘧啶衍生物，是由活性成分替加氟、奧替拉西鉀和吉美嘧啶組成的復合制劑，生物利用度好，作用時間長，能減輕化療藥物氟尿嘧啶的不良反應〔13〕。張杭等〔14〕研究表明，替吉奧聯合多西他賽治療局部晚期胃癌，能顯著降低血清中腫瘤轉移侵襲相關指標表達水平，提高近期療效、預后生活質量，并減低毒副反應。郁昊等〔15〕研究表明，替吉奧輔助多西他賽、奧沙利鉑對晚期胃癌進行化療治療，可顯著降低患者血清腫瘤標志物水平，并抑制血管新生因子及細胞侵襲分子釋放。黃丹等〔16〕研究表明，替吉奧聯合草酸鉑可能通過調控ATK信號通路抑制胃癌細胞侵襲。本研究結果提示替吉奧可以抑制大腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，且其濃度越高，抑制作用越強，但具體調控機制尚不明確。

大腸癌的發生發展涉及多種信號通路的多階段、多步驟過程。PI3K/AKT信號通路是重要的細胞內信號通路，調節細胞增殖、細胞凋亡、細胞轉化等各種細胞功能，與癌癥發生發展亦密切相關〔17〕。研究表明，AKT信號通路在許多腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲過程中均發揮重要作用，AKT是PI3K下游調控腫瘤發生發展的核心靶基因，PI3K激活后使其發生磷酸化，將信號傳遞至下游底物，調節凋亡、轉錄及翻譯等生物學效應〔18〕。PCNA參與DNA甲基化、DNA修復、染色質重塑等多種細胞代謝途徑，是一個非致癌的抗癌靶點〔19〕。劉皓葳等〔20〕研究發現，下調PCNA蛋白表達可能抑制大腸癌細胞增殖。MMP-9是一種蛋白水解酶，在腫瘤細胞轉移、侵襲、新生血管形成、降解基底膜等過程中發揮重要作用，是惡性腫瘤細胞轉移、侵襲的潛在標志〔21〕。覃輝等〔9〕研究表明，替吉奧在抑制胃癌細胞侵襲、促進胃癌細胞凋亡過程中能顯著下調MMP-9蛋白表達。本研究結果提示替吉奧可能通過抑制PI3K/AKT信號通路相關蛋白AKT、PI3K磷酸化，進而下調PCNA、MMP-9蛋白表達，發揮抑制大腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

綜上所述，替吉奧可能通過抑制AKT信號通路激活，發揮抑制大腸癌細胞HT-29增殖、遷移和侵襲的作用。但替吉奧對其他大腸癌細胞系的作用是否也是如此尚不明確，另對大腸癌細胞凋亡、細胞周期、促血管生成的影響亦不清楚，還需進一步研究。