干細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠NO、ET-1、MMP-9的影響

王磊 方葉青 艾文 陳之杰 邱小燕 李華英 謝培益

(華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院心血管內(nèi)科，深圳 南山 518000)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是動(dòng)脈壁多種細(xì)胞遭受各種因素影響出現(xiàn)的慢性炎癥發(fā)展，是腦梗死和心臟動(dòng)脈疾病的主要病因〔1〕。動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞分化增加，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子導(dǎo)致血管通透性改變，大量的鈣離子穿過(guò)血管內(nèi)膜，增加血管內(nèi)鈣離子濃度，損傷部位形成堆積，誘導(dǎo)疾病產(chǎn)生〔2〕。大量研究發(fā)現(xiàn)，頸動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈是極易出現(xiàn)斑塊的部位，導(dǎo)致血液供應(yīng)不足，如不及時(shí)治療導(dǎo)致多種心腦血管疾病產(chǎn)生，威脅患者生命安全〔3〕。

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AS的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體炎癥水平及多種血管因素水平密切相關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9對(duì)細(xì)胞的生物活性具有重要作用。對(duì)AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用〔4〕。內(nèi)皮素(ET)-1由多個(gè)氨基酸組成的生物活性肽，是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子。一氧化氮(NO)在血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用〔5〕。干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)能夠誘導(dǎo)血管多種細(xì)胞進(jìn)行分化和增殖，并對(duì)受損的心腦血管相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)及再生作用，在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要保護(hù)因子作用〔6〕。本研究旨在探討HGF對(duì)AS大鼠NO、ET-1、MMP-9的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 SPF級(jí)SD大鼠40只，由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，10只為正常組，其余大鼠建立AS模型，分為三組，為AS組和HGF1組和HGF2組，AS組不進(jìn)行HGF干預(yù)，HGF1組和HGF2組分別進(jìn)行劑量為10 mg/(kg·d)和30 mg/(kg·d)的HGF干預(yù)，干預(yù)時(shí)間為12 w。

1.2AS模型建立 AS組和HGF1組和HGF2組在腹腔處注射700 000 U/kg的維生素D，注射3 d后，進(jìn)行高級(jí)飼料喂養(yǎng)〔在給予基礎(chǔ)飼料(81%)的方案上添加10%豬油、4%膽固醇、5%白糖〕，正常組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，建模成功標(biāo)準(zhǔn)：主動(dòng)脈出現(xiàn)斑塊脫落，符合AS病理學(xué)特征視為造模完成。造模成功后，HGF1組和HGF2組進(jìn)行灌胃10 mg/(kg·d)和30 mg/(kg·d)的HGF，其余組灌胃同體積的生理鹽水，連續(xù)喂養(yǎng)12 w后，處死大鼠，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠主動(dòng)脈造模情況。

1.3HE染色檢測(cè)各組胸主動(dòng)脈病理 各組隨機(jī)安樂(lè)死5只大鼠，提取胸主動(dòng)脈組織，甲醛固定，酒精透水，PBS透明。石蠟包埋后，24 h后，采用HE染色，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，利用顯微鏡觀察胸主動(dòng)脈病理變化。

1.4各組血脂檢測(cè) 各組抽取空腹靜脈血2 ml，離心15 min，采用免疫比濁法檢測(cè)總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的水平。

1.5各組血清中NO、ET-1的水平 將靜脈血離心保留血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)NO、ET-1的水平。

1.6細(xì)胞炎性因子檢測(cè) 各組隔夜清晨無(wú)進(jìn)食時(shí)，抽取靜脈血，3～5 ml，離心，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定血清細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。

1.7Western印跡檢測(cè)胸主動(dòng)脈組織MMP-9蛋白表達(dá) 在6孔板中加入100 μg的胰蛋白酶提取液，在注入2 ml的培養(yǎng)基停止消化，再將細(xì)胞提取液放入EP管中，并與胰蛋白酶提取液按照1∶100進(jìn)行混合，再放入冰箱中冷凍10 min。使細(xì)胞完全裂變，成為E溶液；在EP管中放入各組胸主動(dòng)脈組織并按照1∶100比例加入胰蛋白酶提取液2 ml，使細(xì)胞完全裂變，成為F溶液；再把E和F溶液以80∶1的體積進(jìn)行搖勻，配制成工作液，放入37.5℃的保溫箱中20 min，冷卻后計(jì)算MMP-9蛋白的濃度。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HGF對(duì)各組大鼠胸主動(dòng)脈病理變化影響 正常組結(jié)構(gòu)良好，平滑肌緊致排列，外膜較厚，無(wú)病變組織。AS組內(nèi)皮細(xì)胞增厚，血管內(nèi)皮出現(xiàn)病理改變，厚薄不均勻，呈現(xiàn)平滑肌纖維化趨勢(shì)。HGF1組血管結(jié)構(gòu)正常，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞脫落較AS組改善。HGF2組血管結(jié)構(gòu)清除，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)好于AS組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈病理變化(HE染色，×400)

2.2HGF對(duì)各組大鼠血清中血脂、NO、ET-1、水平的影響 AS組與正常組相比在血脂、NO、ET-1、水平均差異顯著(P<0.05)，HGF1組與AS組TC、LDL-C、NO、ET-1指標(biāo)上有明顯差異(P<0.05)，HGF2組與HGF1組TG、TC、HDL-C及LDL-C、NO水平均差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3HGF對(duì)各組大鼠血清中IL-6、TNF-α水平的影響 與正常組相比，AS組IL-6、TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)，與AS組比較，HGF1組和HGF-2組IL-6水平均明顯下降，且HGF2組明顯低于HGF1組(P<0.05)，HGF2組TNF-α均明顯低于HGF1、AS組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 HGF對(duì)各組大鼠血清中血脂、NO、ET-1、炎癥因子水平的影響

2.4HGF各組胸主動(dòng)脈組織中MMP-9蛋白水平的影響 AS組MMP-9蛋白水平(0.86±0.13)明顯高于正常組(0.25±0.03，P<0.05)，與AS組相比，HGF1組、HGF2組水平MMP-9蛋白(0.71±0.09，0.43±0.06)明顯低于AS組(P<0.05)，HGF2組明顯低于HGF1組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠組織中MMP-9蛋白表達(dá)

3 討 論

AS的形成較復(fù)雜，經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)研究人員的不斷探索，先后提出多種病理，如內(nèi)皮質(zhì)、血脂、炎癥水平相關(guān)等〔7,8〕。但是目前研究認(rèn)為該疾病的形成與多種原因共同導(dǎo)致有關(guān)，臨床多采用口服抗凝藥物治療，但是該種藥物血液濃度較低，長(zhǎng)時(shí)間服用，耐藥性增加〔9〕。

HGF具有強(qiáng)烈的促進(jìn)血管生成作用，是神經(jīng)系統(tǒng)首選藥物〔10〕。研究表明，HGF能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞的有絲分裂，對(duì)損傷血管有提高血液流速的作用，加快心臟供養(yǎng)能力的恢復(fù)，加快損傷器官的血液供應(yīng)〔11〕。本研究說(shuō)明HGF能夠降低大鼠的血脂，具有緩解病情作用。血脂代謝功能失調(diào)與AS的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性〔12〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，AS模型大鼠采用高級(jí)飼料喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)血脂水平急劇升高，并在大鼠動(dòng)脈觀察有脂質(zhì)顆粒沉積，說(shuō)明兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)〔13〕。模型大鼠血管內(nèi)皮損傷加劇，腎素-血管緊張素-醛固醇系統(tǒng)(RAAS)水平升高，HGF能夠修復(fù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低RAAS水平，降低血脂水平。楊婷等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)HGF能夠改善冠狀動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清的血脂水平，與減少單核細(xì)胞增加損傷血管內(nèi)皮，緩解病情。這與楊清等〔15〕研究結(jié)果相似。

斑塊中的巨噬細(xì)胞具有調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的作用，多種細(xì)胞因子水平上升，而當(dāng)血管內(nèi)皮功能障礙時(shí)，血管收縮反應(yīng)嚴(yán)重，ET-1水平升高時(shí)會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)血小板大量增殖及聚集，有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)使用ET-1拮抗劑時(shí)NO表達(dá)上升，并抑制斑塊形成〔16〕。說(shuō)明ET-1和NO表達(dá)及作用具有負(fù)相關(guān)性。HGF通過(guò)對(duì)可以通過(guò)修復(fù)損傷血管內(nèi)皮，增加血液微循環(huán)，并誘導(dǎo)多種效應(yīng)蛋白表達(dá)，減少血管炎癥反應(yīng)，降低IL-6及TNF-α水平〔17〕。Luo等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)HGF生物活性較廣泛，有效改善血管壁變薄，并隨著HGF濃度的升高，ET-1水平逐漸減少，NO水平升高發(fā)揮保護(hù)血管功能，改善病情。這與本文研究結(jié)果相似。大量研究證實(shí)，AS患者體內(nèi)血清中MMP-9表達(dá)活躍，如不及時(shí)控制會(huì)導(dǎo)致斑塊的損傷及破裂〔19〕。HGF能夠通過(guò)抑制斑塊形成，減少血管內(nèi)皮損傷降低MMP-9水平，這與趙晟昊等〔20〕研究結(jié)果相似。