丁苯酞對(duì)腦癱大鼠PI3K/Akt信號(hào)通路及海馬神經(jīng)元凋亡的影響

袁琳 李潔 王芳 李可

(1蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年科，江蘇 蘇州 215101；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科監(jiān)護(hù)室)

腦性癱瘓(腦癱)是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性腦損傷疾病，其主要臨床特征是肌張力、運(yùn)動(dòng)和運(yùn)動(dòng)技能異常〔1,2〕，研究報(bào)道，我國(guó)腦癱患病率為5.40%〔3〕。因此研究腦癱的發(fā)病機(jī)制，對(duì)其臨床治療有重要意義。研究表明，凋亡是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和自然死亡的重要過程，凋亡機(jī)制紊亂會(huì)引起缺血性腦血管病、帕金森病等多種神經(jīng)疾病的發(fā)生〔4,5〕，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是組織細(xì)胞內(nèi)的中央網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡，并參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)〔6〕。丁苯酞是一種具有抗腦缺血作用的藥物，能夠有效治療腦梗死、缺血性腦血管疾病〔7,8〕。然而，丁苯酞在腦癱中的作用研究報(bào)道較少，本研究通過觀察丁苯酞對(duì)腦癱大鼠的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)SD大鼠75只，8周齡，體重約為250 g，由北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SYXK(京)2015-0002，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2試劑及儀器 丁苯酞(貨號(hào)： hzm2479)購(gòu)自上海滬崢生物科技有限公司；蘇木素染液(貨號(hào)：G1080)、伊紅染液(貨號(hào)：G1100)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL試劑盒(貨號(hào)：C1086)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；PI3K抗體(貨號(hào)：ab32089)、AKT抗體(貨號(hào)：ab38449)、p-AKT抗體(貨號(hào)：ab8805)、GAPDH抗體(貨號(hào)：ab181602)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體(貨號(hào)：ab182858)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體均購(gòu)自美國(guó)abcam公司；p-PI3K抗體(貨號(hào)：XGK0788)購(gòu)自上海西格生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(貨號(hào)：BHR101)購(gòu)自北京博爾西科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：P0010S)購(gòu)自上海碧云天公司；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置(型號(hào)：AU5800)購(gòu)自北京市六一儀器廠；酶聯(lián)免疫分析儀(型號(hào)：EVO75)購(gòu)自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號(hào)：MDF-U32V)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1腦癱大鼠模型構(gòu)建及分組 將75只SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、丁苯酞低、中、高劑量組各15只。丁苯酞低、中、高劑量組：腹腔分別注射丁苯酞20、40、80 mg/(kg·d)；假手術(shù)組、模型組：腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)注射3 d。末次給藥2 h后，參考文獻(xiàn)〔9〕制備腦癱大鼠模型：除假手術(shù)組外，其余大鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)進(jìn)行麻醉，在頸部鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，用0號(hào)線進(jìn)行結(jié)扎，迅速縫合傷口，大鼠自然蘇醒后，將其置于封閉的缺氧箱中，箱中通入92%氮?dú)?8%氧氣的混合氣體，維持2 L/min的流速，箱內(nèi)溫度37℃，2 h后取出大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，假手術(shù)組大鼠僅鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，其他干預(yù)與模型大鼠相同。本研究模型構(gòu)建成功率為100%。

1.3.2各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分 術(shù)后24 h后，參考文獻(xiàn)〔10〕對(duì)各組神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分：0分，大鼠行為正常；1分，大鼠右前肢伸展不完全；2分，大鼠行走過程中轉(zhuǎn)圈；3分，大鼠行走中出現(xiàn)傾倒；4分，大鼠意識(shí)喪失，無行走能力。重復(fù)評(píng)定3次，取平均值作為最終評(píng)分，評(píng)分在1～3分說明模型制備成功。

1.3.3蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組海馬區(qū)組織病理變化 各組神經(jīng)功能損傷評(píng)分后，每組取5只大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，處死大鼠，分離腦組織，用4%多聚甲醛固定，做常規(guī)石蠟切片，海馬吻合位置連續(xù)冠狀切片(4 μm)。用HE染色，每張切片選取5個(gè)視野，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織海馬區(qū)病理學(xué)改變。

1.3.4TUNEL染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況 每組選取5只大鼠，同1.3.3方法分離腦組織，將海馬組織切片，于二甲苯、不同濃度乙醇中浸泡5 min后，用蛋白酶K室溫消化1 h后，按TUNEL試劑盒說明書將切片進(jìn)行染色、終止反應(yīng)、封片等，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡數(shù)目。經(jīng)TUNEL染色的陽性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.3.5Western印跡檢測(cè)各組海馬區(qū)Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 提取海馬組織總蛋白，BCA法測(cè)其濃度，按蛋白30 μg /孔上樣進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別加入一抗(抗Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GAPDH抗體，1∶1 000)，4℃下過夜培養(yǎng)，次日加二抗(1∶5 000)，溫室中培養(yǎng)1 h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法進(jìn)行顯色，用GAPDH作內(nèi)參，掃描膠片，Tanon600圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)分〕相比，模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分〔(2.78±0.29)分〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分〔(2.42±0.26)分、(2.40±0.25)分、(1.73±0.19)分〕顯著降低(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.05)。

2.2各組海馬區(qū)組織病理變化 假手術(shù)組海馬區(qū)細(xì)胞飽滿、排列緊密、結(jié)構(gòu)清晰；與假手術(shù)組相比，模型組海馬區(qū)細(xì)胞排列稀疏紊亂、胞體減小、出現(xiàn)細(xì)胞核破裂現(xiàn)象；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)細(xì)胞上述病理癥狀明顯減輕。見圖1。

2.3各組海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術(shù)組〔(3.24±0.25)%〕相比，模型組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率〔(30.18±2.43)%〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率〔(22.36±2.65)%、(21.45±2.12)%、(16.13±1.73)%〕顯著降低(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 各組海馬組織HE染色(×200)

圖2 各組海馬神經(jīng)元凋亡TUNEL染色(×200)

2.4各組海馬區(qū)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組海馬區(qū)Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組海馬區(qū)Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖3、表1。

2.5各組海馬區(qū)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組海馬區(qū)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組海馬區(qū)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表1、圖4。

1～5：假手術(shù)組，模型組，丁苯酞低劑量組，丁苯酞中劑量組，丁苯酞高劑量組；圖4同圖3 各組海馬區(qū)Bax、BcL-2蛋白表達(dá)

表1 各組海馬區(qū)Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)比較

圖4 各組海馬區(qū)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來，腦癱的患病率逐年上升〔11〕。腦癱是由于缺氧缺血而導(dǎo)致大腦損害引起的，造成肢體殘疾，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量〔12,13〕。因此，研究腦癱的病因及病理特征，有利于其臨床診治。本研究結(jié)果與趙鵬舉等〔14〕研究結(jié)果一致，提示腦癱大鼠模型構(gòu)建成功，腦癱引起大鼠神經(jīng)功能缺損。丁苯酞是芹菜揮發(fā)油的主要成分，對(duì)缺血性腦損傷疾病有較好的治療作用，江玲軍等〔15〕研究顯示，丁苯酞對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能具有保護(hù)作用。袁齊宏等〔16〕研究顯示，丁苯酞預(yù)處理可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能，達(dá)到較好的腦保護(hù)作用。本研究結(jié)果提示丁苯酞可以改善腦癱大鼠病理癥狀，減輕其神經(jīng)功能損傷。

神經(jīng)細(xì)胞凋亡與腦癱的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Bax是一種促凋亡因子，Bcl-2是抑凋亡因子，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡過程〔17〕。本研究結(jié)果與王新琳等〔18〕研究結(jié)果一致，提示腦癱引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加與Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。魯玉霞等〔19〕研究顯示，通過下調(diào)Caspase-3、Bax mRNA及蛋白、上調(diào)Bcl-2 mRNA及蛋白，可以減少大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。陳曉莉等〔20〕研究顯示，丁苯酞通過抑制凋亡因子蛋白表達(dá)從而抑制細(xì)胞壞死性凋亡，減輕小鼠腦缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果提示丁苯酞可以促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦癱大鼠神經(jīng)功能損傷。

PI3K/Akt信號(hào)通路是抗凋亡通路。Zhang等〔21〕研究顯示，調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路可以抑制海馬神經(jīng)元凋亡，改善腦癱大鼠相關(guān)的缺陷。劉紅欣等〔22〕研究顯示，PI3K/Akt信號(hào)通路參與電針刺激頭部運(yùn)動(dòng)區(qū)對(duì)腦癱鼠腦損傷區(qū)神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白的調(diào)控，在促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)的作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果提示，PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)與腦癱發(fā)生有關(guān)。Cho等〔23〕研究顯示，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，可以抑制海馬細(xì)胞凋亡，改善腦癱大鼠短期記憶。本研究結(jié)果提示，丁苯酞可以促進(jìn)PI3K、Akt磷酸化蛋白表達(dá)，推測(cè)丁苯酞可能通過促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路激活，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上，丁苯酞可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，調(diào)控凋亡相關(guān)因子表達(dá)，抑制腦癱大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善腦癱大鼠病理癥狀，減輕其神經(jīng)功能損傷，但由于本研究未對(duì)特異性干預(yù)通路進(jìn)行驗(yàn)證，其具體作用機(jī)制有待后續(xù)研究。