極低頻電磁場對局灶性腦缺血大鼠神經功能缺失恢復的影響及機制

歐陽葵 梁培日 吳挺國 周德聰 陳增 周經霞

(1海南省干部療養院(海南省老年病醫院)，海南 海口 571100；2海南醫學院第二附屬醫院)

缺血性腦卒中患者多發于老年人群，具有很高的復發率、致殘率、死亡率，極大影響患者的生命安全和生活質量〔1〕。腦損傷后導致大腦皮質運動區神經元死亡，突觸結構異常導致神經遞質釋放功能障礙引起一系列癥狀，包括認知功能障礙、運動功能障礙等，還包括大腦皮層、海馬等部位膽堿能神經元的缺失和功能異?！?〕。電磁場的生物效應實驗提示，生命體與低頻電磁場表現出關聯性、協同性及與頻率時間相關的特性〔3〕。近年來實驗報道了穩恒磁場和中頻、高頻電磁場對細胞、組織、活體的影響〔4〕。但在缺血性腦卒中后受損的中樞神經系統恢復中作用的研究仍十分少見。本研究旨在探討極低頻電磁場對局灶性腦缺血大鼠神經功能缺失恢復的影響及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 清潔級成年SD雄性大鼠180只，7～8 周齡，體重250～280 g，購于海南省醫學實驗動物中心，許可證號：SYXK(瓊)2017-0013。適應性喂養7 d后，隨機分為對照組(假手術)、模型組(局灶性腦缺血模型)、極低頻電磁場治療組，每組60只。根據實驗設計將上述3組進一步隨機分為6個亞組，分別為治療前及治療后3、7、14、21、30 d，每個亞組10只。

1.2主要試劑與儀器 TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于上海翌圣生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、過氧化氫酶檢測試劑盒均購于南京諾爾曼生物技術有限公司。HR-6型手持高速勻漿機購于上海滬析實業有限公司；水迷宮購于上海基爾頓生物科技有限公司；CX43型光學顯微鏡購于奧林巴斯(中國)有限公司。

1.3大鼠局灶性腦缺血模型制備 采用大鼠大腦中動脈栓塞模型(MCAO)模擬腦缺血再灌注損傷。大鼠麻醉進行氣管插管和機械通氣，頸部正中皮膚切開，鈍性分離暴露左側頸總動脈、頸外動脈和勁內動脈分盆口處，電凝器夾閉甲狀腺上動脈，臨時結扎翼腭動脈，結扎頸外動脈遠心端，以動脈夾臨時夾閉頸總動脈和頸內動脈，于頸外動脈上做一切口，插入硅膠頭線栓，沿頸外動脈進入頸內動脈，到達大腦中動脈起始部后開始計時缺血時間，隨后固定線栓，放開頸總動脈和翼腭動脈并縫合切口，待大鼠清醒后拔除氣管導管。缺血60 min后，完全拔出線栓，待大鼠清醒后放回籠中喂養。對照組除不插入線栓外，其余步驟同手術組。

1.4極低頻電磁場刺激方案 磁場裝置運行期間磁場環境均勻穩定，電磁場頻率固定為5 Hz，磁感應強度為0～140 mT連續可調。在大鼠標準評估結束后，將極低頻電磁場治療組暴露磁感強度調為140 mT，暴露時間為5 h，連續暴露30 d。在電磁場中，大鼠的活動不受任何限制。暴露到電磁場前后分別測量大鼠溫度，暴露在電磁場中引起的肛溫上升不超過0.2℃。對照組和模型組不進行極低頻電磁場暴露。

1.5水迷宮實驗 各亞組在相應時間點進行水迷宮實驗，首先進行2次訓練，第1次訓練將大鼠放入水池邊緣，計時180 s，到時間后若仍未上到平臺，則主動將大鼠置于平臺上10 s，之后放入籠中靜置5 min，進行第2次培訓，方法同第1次。培訓結束后5 min進行檢測，記錄上到平臺的時間，若180 s仍未上到平臺則將時間記錄為180 s。

1.6標本采集與處理 各亞組水迷宮實驗結束1 h后，全麻后斷頭處死，其中5只取出全部腦組織后立即稱重(濕重)，之后放入烤箱中100℃烘干24 h并稱重(干重)，計算腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。另外5只腦組織取出后一半放入多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋用于海馬CA1區凋亡陽性神經元檢測；另外一半腦組織放入生理鹽水中洗去殘血，濾紙吸干，按1∶5比例經冷的生理鹽水，使用手持組織勻漿機12 000 r/min勻漿2 min，5 000 r/min、4℃恒溫離心10 min，收集上清液，-20℃保存，6 h內完成檢測。

1.7大鼠海馬CA1區神經元凋亡情況檢測 取大鼠腦組織蠟塊，置于大鼠腦模中切取海馬位置，5 μm連續切片，放于明膠包被的顯微鏡載玻片上，自然風干，使用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒進行測定，在高倍鏡(×400)視野下觀察并拍照，使用Image J軟件計數海馬CA1區凋亡陽性神經元數目。

1.8大鼠腦組織SOD、丙二醛、過氧化氫酶水平檢測 取治療前和治療后30 d大鼠腦組織勻漿，黃嘌呤氧化酶法測定SOD水平，硫代巴比妥酸反應物法測定丙二醛水平，過氧化氫與乙酸-重鉻酸鉀反應顯色比色法測定過氧化氫酶水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.9統計學分析 使用SPSS25.0統計學軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1不同時間點各組學習記憶能力比較 治療前模型組和極低頻電磁場治療組達到高臺所需時間明顯長于對照組(P<0.01)；而兩組差異無統計學意義(P>0.05)。治療后極低頻電磁場治療組達到高臺所需時間明顯短于治療前和模型組(P<0.01)；其中治療后3、7、14、21 d隨著治療時間的延長大鼠達到高臺所需時間逐漸縮短。見表1。

表1 不同時間點各組學習及記憶能力比較

2.2不同時間點各組腦組織含水量比較 治療前模型組和極低頻電磁場治療組腦組織含水量明顯高于對照組(P<0.01)；而兩組差異無統計學意義(P>0.05)。治療后極低頻電磁場治療組腦組織含水量明顯低于治療前和模型組(P<0.05)；隨著治療時間的延長大鼠腦組織含水量逐漸減少。見表2。

表2 不同時間點各組腦組織含水量比較

2.3不同時間點各組海馬CA1區凋亡陽性神經元數目比較 治療前模型組和極低頻電磁場治療組大鼠海馬CA1區凋亡陽性神經元數目明顯高于對照組(P<0.01)；而兩組差異無統計學意義(P>0.05)。治療后極低頻電磁場治療組海馬CA1區凋亡陽性神經元數目明顯低于治療前和模型組(P<0.01)；隨著治療時間的延長大鼠海馬CA1區凋亡陽性神經元數目逐漸減少。見表3，圖1。

表3 不同時間點各組海馬CA1區凋亡陽性神經元數目比較(個，

圖1 不同時間點各組海馬CA1區凋亡陽性神經元(TUNEL染色，×400)

2.4各組腦組織勻漿中SOD、丙二醛、過氧化氫酶水平比較 治療前模型組和極低頻電磁場治療組腦組織勻漿中SOD、過氧化氫酶水平明顯低于對照組，丙二醛水平明顯高于對照組(P<0.05)；而兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后30 d極低頻電磁場治療組SOD、過氧化氫酶水平明顯高于模型組，丙二醛水平明顯低于模型組(P<0.05)。見表4。

表4 各組腦組織勻漿中SOD、丙二醛、過氧化氫酶水平比較

3 討 論

興奮在神經元上以電信號形式傳導在大腦信息處理中發揮重要作用，動作電位閾下電流或弱電場會影響神經細胞活性〔5〕。近年來研究發現，體外培養的大腦皮質錐體細胞和腦片對外加弱電場有明顯反應〔6〕。弱電場或磁場能夠敏感地調節錐體細胞腦電振蕩和放電頻率，可推測閾下電磁刺激能夠誘發神經元的去極化或超極化，改變興奮性〔7〕。外加電場在顱內直接形成電場的同時，產生誘發電流能夠影響腦組織中神經元的興奮性〔8〕。體內的神經元與體外培養的神經元相比活性更強，且處于神經網絡中，相互間聯系緊密，對于誘發電流的敏感性更高〔9〕。合理使用弱電場對大腦的影響，可能成為一種保護神經功能，促進神經康復的重要手段。缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，具有很高的致殘率和致死率，通過科學的治療手段預防和改善缺血性腦卒中后繼發的多種功能障礙問題，降低后遺癥發生率，對提高患者生活質量，促進神經功能恢復具有重要意義。

本研究參考大鼠腦電生理頻率設定電場刺激頻率，進行體外極低頻電磁場刺激，結果提示局灶性腦缺血后大鼠的學習記憶能力明顯降低；極低頻電磁場治療能夠有效提升局灶性腦缺血后大鼠的學習記憶能力。本研究結果顯示，極低頻電磁場治療能夠明顯降低局灶性腦缺血大鼠腦組織含水量并延長低含水量的持續時間，避免嚴重腦水腫的發生?？赡茉驗?，極低頻電磁場改變了血液流變特征和離子流動方向，誘發血管擴張和血流速增加，改善局部微循環，促進血腦屏障的恢復。海馬是大腦半球皮質內側緣部分，是研究學習記憶能力的重要位置；CA1區是大腦海馬區的重要組成部分，CA1區神經元參與對空間信息的編輯、加工，是學習記憶能力的主要負責區域之一，當神經元受到刺激啟動細胞凋亡程序后，隨著凋亡數量的增加可能出現記憶力下降、老年癡呆等〔10〕。本研究結果顯示，極低頻電磁場治療能夠明顯降低局灶性腦缺血大鼠海馬CA1區凋亡陽性神經元數目，有利于改善學習記憶能力。

缺血性腦損傷是多種因素共同作用的結果，其中氧自由基損傷是重要因素之一〔11〕；腦缺血再灌注過程中大量生成氧自由基和脂質過氧化物，破壞了膜脂質結構和酶蛋白微環境，同時自由基還能夠誘發酶蛋白結構改變，造成酶活性喪失〔12〕。腦缺血時會大量生成自由基，激活過氧化反應，進而破壞膜蛋白質結構。SOD是人體中具有氧自由基清除活性的金屬酶，在維持氧化和抗氧化平衡中發揮關鍵作用〔13〕。過氧化氫酶能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣〔14〕。丙二醛是自由基的降解產物，能夠反映自由基水平，脂質過氧化產物中其對膜蛋白有很強的破壞作用；同時丙二醛還能夠與部分多肽和蛋白質相互作用，阻礙細胞正常代謝，引發神經細胞損傷〔15〕。本研究結果提示局灶性腦缺血大鼠腦組織中SOD、過氧化氫酶低表達，丙二醛高表達；極低頻電磁場能夠有效升高大鼠腦組織中SOD、過氧化氫酶表達，降低丙二醛表達，進而改善內源性抗氧化系統功能，減少海馬神經細胞損傷，促進神經功能缺失恢復。