不同工藝醬香型白酒揮發(fā)性物質差異分析

張曉婕，邱樹毅，曾慶軍，何 歡，戴怡鳳，周鴻翔

（貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，已有兩千多年的歷史。與其他蒸餾酒相比，白酒發(fā)酵是一個復雜的過程，同時進行糖化和發(fā)酵。醬香型白酒具有醬香，略有焦香，色澤微黃，酒體醇厚，香味悠長，受到廣大消費者的喜愛。白酒風味主要由微量成分決定，目前，在白酒中已發(fā)現了2 000多種風味物質，使白酒具有獨特的香氣特征。醬香型白酒根據生產工藝的不同被分為稛沙酒、碎沙酒、翻沙酒等。稛沙酒即傳統(tǒng)的大曲醬香白酒，是第1到第7輪次酒的組合；翻沙酒即第8輪次酒，量少、味苦且焦糊味重，一般較少用作成品酒的基酒，多用作調味酒；碎沙酒的原料是酒糟、高粱和大曲（或活性酵母），是利用第7或第8輪次酒的酒糟，加入粉碎的高粱和大曲（或活性酵母）進行發(fā)酵蒸餾所得。不同工藝醬香型白酒之間的風味及香氣特征差異較大。目前市場上主流的醬香型白酒為稛沙酒和碎沙酒。

隨著醬香型白酒的發(fā)展，人們對其品質的要求也越來越高，目前白酒鑒別主要依靠感官品評，這種方法綜合性強但局限性較大，易受個體和環(huán)境因素影響，且對評價結果只能描述，無法對差異進行量化表達。近年來，國內外逐漸采用儀器分析結合化學計量學方法進行酒的風味鑒別和差異研究。其中，氣相色譜（gas chromatography，GC）及氣相色譜-質譜（GC-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術已被廣泛應用于白酒中揮發(fā)性物質的定性定量分析。此外，不是所有揮發(fā)性物質對白酒香氣產生都有影響，香氣活性值（odor activity value，OAV）可用于表征揮發(fā)性物質在食品香氣中的貢獻程度，有利于識別重要氣味物質。通常認為OAV不低于1的物質對白酒香氣有貢獻，利用OAV可以確定白酒的重要風味成分、骨架成分并初步判斷潛在差異物質。

由于儀器分析所得數據往往量大且存在很多與鑒別不相關的信息，不能直接用于差異研究，常采用化學計量學方法對儀器采集數據進行分析。作為常用的多元統(tǒng)計分析方法，主成分分析（principal components analysis，PCA）通過線性變換將相關變量轉化為一組最能代表數據特征的變量，用于初步探索數據內部結構和樣品聚類；偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）或正交偏最小二乘判別分析（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）是有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計方法，通過建立物質分析數據與樣品類別之間的關系模型，實現對樣品類別的預測，并通過計算變量投影重要性（variable importance for the projection，VIP）衡量各物質對分類判別的影響強度和解釋能力，從而輔助潛在差異物質的篩選（通常以VIP值大于1.0作為篩選標準）；聚類分析可以直觀表達各物質在不同樣品之間的差異，對所采集樣品進行分類，特征相似的樣品聚集在一起。儀器分析結合化學計量學的方法已被應用于各種酒類、食品等的鑒別分析中。Vaclavik等采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜檢測了3 種不同地理來源的葡萄酒品種，采用PCA和PLS-DA探索數據結構并構建分類模型，能對96%的樣品進行正確分類。

迄今為止，對不同產地、不同輪次、不同香型、不同年份的白酒進行了很多分類研究，然而，對不同工藝醬香型白酒的差異研究較少。郭世鑫等采用紫外光譜、GC-MS、離子色譜結合PCA的方法探索不同工藝、輪次醬香型白酒的吸光度、揮發(fā)性化合物的差異，并采用PLS-DA確定了5 種重要標記化合物，為不同工藝醬香型白酒的差異分析提供了一定參考，但并未實現稛沙酒和碎沙酒的鑒別。目前，稛沙酒和碎沙酒的鑒別主要還是以感官品評為主。因此，研究稛沙酒和碎沙酒之間的差異并提供一種更客觀、高效、準確的方法非常重要。

本研究采用GC和GC-MS對兩種不同工藝醬香型酒樣（稛沙酒和碎沙酒）中揮發(fā)性物質進行定性及定量分析，利用PCA和OPLS-DA構建兩種酒樣的鑒別模型，對模型進行驗證以判斷其準確率，同時篩選出兩種酒樣的潛在差異物質，繪制熱圖并進行層次聚類分析，進一步驗證潛在差異物質對區(qū)分兩種酒樣的有效性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：23 個稛沙酒樣，25 個碎沙酒樣，均為乙醇體積分數53%的醬香型白酒，采購自貴州省仁懷地區(qū)，酒樣年份均為實驗上一年生產。所有酒樣均在室溫下密封避光貯存。

無水乙醇（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；標準品：乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、正丁醇、辛醇、1,2-丙二醇、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、乙縮醛、乙偶姻、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、糠醇、糠醛、苯乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸戊酯、叔戊醇、2-乙基丁酸（色譜純，純度≥97.0%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醛（色譜純，純度≥99.5%）美國Sigma-Aldrich公司；2-甲基丁酸乙酯（色譜純，純度≥99.0%） 上海賢鼎生物科技有限公司；異戊醇、乙酸苯乙酯 上海易恩化學技術有限公司；2,3-丁二醇（色譜純，純度≥98.0%） 上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C GC-MS儀、7890A GC儀 安捷倫科技（中國）有限公司；PAL多功能自動進樣器 瑞士斯特分析儀器有限公司；Millipore-Q超純水系統(tǒng) 密理博（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 配制混合酒樣

隨機選擇了同一企業(yè)同一年份的稛沙和碎沙酒樣，按稛沙酒∶碎沙酒為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1配制成9 種不同體積比的混合酒樣，在室溫下密封避光貯存，用于驗證鑒別模型的適用性。

1.3.2 酒樣前處理

取適量酒樣，使用0.22 μm有機濾膜過濾酒樣，吸取990 μL過膜后的酒樣于2 mL氣相進樣瓶中，加入10 μL混合內標溶液（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸，體積分數均為1%），加蓋密封，備用待測。

1.3.3 GC-MS條件

GC條件：SH-Rtx-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度99.999%），流速1.00 mL/min；進樣口溫度250 ℃；分流進樣，分流比30∶1；溶劑延遲2 min；氫氣流量30 mL/min；空氣流量300 mL/min；尾吹氣流量30 mL/min；升溫程序：初始溫度30 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升溫至180 ℃，再以15 ℃/min升溫至210 ℃，保持8 min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；全掃描模式，質量掃描范圍/35～550。

1.3.4 GC條件

與1.3.3節(jié)中GC條件一致。

1.3.5 酒樣中揮發(fā)性物質定性分析

通過對比GC-MS直接進樣分析所得總離子流圖與NIST11譜庫中的化合物，對比GC分析所得色譜圖與標準品色譜圖進行酒樣中各揮發(fā)性物質的定性。

1.3.6 酒樣中揮發(fā)性物質定量分析

以待測物與內標物的含量比為橫坐標，峰面積比為縱坐標，建立各揮發(fā)性物質的標準曲線，采用內標標準曲線法定量酒樣中各揮發(fā)性物質含量。所有酒樣重復測定3 次。

1.3.7 OAV計算

根據定量結果結合各揮發(fā)性物質閾值（odor threshold，OT）（μg/L），按下式計算各揮發(fā)性物質OAV：

式中：為各揮發(fā)性物質質量濃度/（mg/L）。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 數據處理

預處理后的數據采用SIMCA 13.0軟件進行PCA、OPLS-DA模型構建及VIP值分析；用MetaboAnalyst 5.0繪制聚類熱圖；用SPSS 26.0軟件進行-檢驗。

1.4.2 PCA和OPLS-DA模型的構建及驗證

從所檢測的稛沙酒樣和碎沙酒樣中各隨機選擇1/5作為測試集，用于后續(xù)模型驗證，剩下4/5作為訓練集以構建鑒別模型。對訓練集樣品數據采用PCA，根據得分圖判斷樣品分布情況，利用Hotelling’s檢驗和DModX法篩選異常值并排除。剩下訓練集樣品數據采用OPLS-DA建立鑒別模型并進行K-fold交叉驗證（＝7），同時對OPLS-DA模型進行200 次置換檢驗，以驗證模型是否過擬合。將測試集樣品數據以及混合酒樣數據代入鑒別模型中，輸出其分類結果。

1.4.3 關鍵差異物質的確定

根據VIP值的大小判斷各揮發(fā)性物質對酒樣差異的貢獻，篩選出VIP值大于1的物質作為潛在差異物質。繪制熱圖并對潛在差異物質進行聚類分析，以進一步證實所篩選潛在差異物質區(qū)分不同酒樣的有效性，進行-檢驗，以小于0.01的物質確定為關鍵差異物質。

2 結果與分析

2.1 不同工藝醬香型白酒揮發(fā)性物質定性定量分析

對48 個酒樣進行定性定量分析，共得到156 個測量值（稛沙及碎沙酒樣各78 個）。由表1可知，共鑒定出37 種揮發(fā)性物質，包括酯類13 種、醇類7 種、酸類7 種、羰基化合物3 種、吡嗪類2 種、呋喃類2 種及芳香族化合物3 種。所得標準曲線的相關系數均大于0.996，線性關系良好；相對標準偏差均小于7%，表明該方法具有良好的精密度。除癸酸乙酯、糠醇、乙酸苯乙酯、-苯乙醇外，稛沙酒樣鑒定出的揮發(fā)性物質的質量濃度均高于碎沙酒樣。

表1 稛沙和碎沙酒樣中揮發(fā)性物質定性定量分析Table 1 Qualitative and quantitative analysis of volatile components in baijiu samples

由表2可知，稛沙酒樣中各類揮發(fā)性物質的質量濃度及所有揮發(fā)性物質的總質量濃度均高于碎沙酒樣，其中酯類的質量濃度最高，其次是酸類和醇類，吡嗪類和芳香族化合物最低。由圖1可知，各類揮發(fā)性物質占所有揮發(fā)性物質的相對含量并非都是稛沙酒樣高，碎沙酒樣中的酯類、酸類和芳香族化合物的相對含量均高于稛沙酒樣。這說明酒樣品質可能與各類揮發(fā)性物質所占比例有關，適宜的配比有利于提升白酒品質。

由表1還可知，揮發(fā)性物質對白酒香氣的貢獻程度。兩種酒樣中乙縮醛、乙醛、丁酸乙酯、乙偶姻、戊酸乙酯、辛酸乙酯的OAV均大于100，對酒樣風味產生具有重要貢獻，說明稛沙和碎沙酒樣的風味主要羰基化合物和酯類產生，與前人研究結果一致。其中，酯類是白酒的重要香氣化合物，是醬香型白酒中最重要、最豐富的物質；醛類是縮醛的前體物質，使白酒香味更加飄逸；縮醛類賦予白酒清香柔和感；而酮類賦予酒體綿柔細膩感。此外，乙醛與乙縮醛的比例在一定程度上是判斷酒質與酒齡的標志之一。稛沙酒樣中糠醛（2.25±0.88）、三甲基吡嗪（1.96±0.97）和丙酸（1.81±1.04）對香氣產生有貢獻，而在碎沙酒樣中其OAV均小于1，對香氣產生貢獻不大，說明這3 種揮發(fā)性物質可能是造成兩種工藝酒樣差異的潛在標記物。

表2 稛沙和碎沙酒樣中各類揮發(fā)性物質的質量濃度及所有揮發(fā)性物質的總質量濃度Table 2 Concentrations of individual and total volatile substances in baijiu samples mg/L

圖1 稛沙和碎沙酒樣中各類揮發(fā)性物質相對含量Fig. 1 Relative contents of volatile components in baijiu samples

2.2 不同工藝醬香型白酒揮發(fā)性物質的差異分析

從測得的156 個數據中隨機選擇30 個作為測試集（稛沙及碎沙酒樣各15 個），其余126 個作為訓練集。

2.2.1 PCA訓練集酒樣數據

前8 個PC累計貢獻率達到82.6%，其中PC1和PC2的貢獻率分別為32.8%、14.9%。由圖2可以看出，兩種酒樣未完全分離，可能是由于酒樣來源于同一地域不同企業(yè)，其生產環(huán)境、條件、工藝等略有差別；還可看出，除一些異常值外，同種工藝酒樣大部分能聚集在一起，但碎沙酒樣分布比稛沙酒樣更集中，說明碎沙酒樣組內差異較小，稛沙酒樣組內差異較大，即同一地域不同企業(yè)生產的碎沙酒樣較接近，而稛沙酒樣則差別相對較大。PCA結果表明，兩種工藝酒樣揮發(fā)性物質分布有一定差異。

此外，分析過程中共排除12 個異常值，其余114 個測量值用于構建鑒別模型及確定潛在差異物質。

圖2 訓練集不同工藝酒樣揮發(fā)性物質PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot for volatile components of baijiug samples in training set

2.2.2 不同工藝酒樣揮發(fā)性物質的鑒別模型構建

圖3 訓練集不同工藝酒樣揮發(fā)性物質OPLS-DA得分圖Fig. 3 OPLS-DA score plot for volatile components from baijiug samples in training set

由圖4可知，置換檢驗截距為0.183，截距為-0.61，且圖中左側的點均低于右側的點，說明該OPLS-DA模型不存在過擬合現象且初始模型最優(yōu)。

圖4 訓練集不同工藝酒樣揮發(fā)性物質OPLS-DA驗證模型Fig. 4 Permutation test of OPLS-DA model for training set

2.2.3 不同工藝酒樣揮發(fā)性物質的鑒別模型驗證

用隨機選取的測試集樣品數據評估鑒別模型的分類能力，模型將各樣品進行分配，測試正確率達93.33%，由圖5可知，只有1 個稛沙酒樣和1 個碎沙酒樣沒有分布到對應區(qū)域，其余測試集酒樣均分配正確，該模型可以較好地對稛沙和碎沙酒樣進行分類。

圖5 測試集不同工藝酒樣揮發(fā)性物質OPLS-DA得分圖Fig. 5 OPLS-DA score plot for volatile components from baijiu samples in testing set

將9 種不同比例混合酒樣的定量結果代入模型，由圖6可知，其中1∶9混合酒樣被識別為碎沙酒，9∶1混合酒樣被識別為稛沙酒，其余酒樣均未被分配到任意一類。

模型對測試集酒樣和混合酒樣的分配結果以及混合酒樣在該模型中的分布情況表明，該鑒別模型不僅能應用于稛沙和碎沙酒樣的分類，同時還可用于混合酒樣的識別，根據混合酒樣在模型中的分布區(qū)域，能大致判斷該混合酒樣中稛沙與碎沙酒樣的比例，從而對混合酒樣品質進行初步鑒別。

圖6 不同比例混合酒樣揮發(fā)性物質OPLS-DA得分圖Fig. 6 OPLS-DA score plot for volatile components from mixed samples in different proportions

2.3 不同工藝醬香型白酒潛在差異物質的確定

VIP大于1可認為該變量為該判別模型的潛在差異物質，且VIP值越大說明該物質在判別過程中的貢獻越大。根據模型VIP值確定了14 種物質作為潛在差異物質（圖7），包括4 種醇（1,2-丙二醇、正丙醇、仲丁醇、異戊醇），4 種酯（乙酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯），2 種酸（丙酸、乙酸），2 種羰基化合物（乙縮醛、乙偶姻），1 種呋喃（糠醛），1 種吡嗪（三甲基吡嗪）。其中，糠醛的VIP值最高（1.833 41），同時由OAV可看出（表1），糠醛對稛沙酒樣的香氣產生有貢獻而對碎沙酒樣香氣貢獻不大，說明糠醛可能是造成稛沙和碎沙酒樣之間差異的重要物質。糠醛在醬香型白酒的呋喃類中含量最高，具有杏仁香，已成為醬香型白酒的一個標志組分，是區(qū)別于其他香型白酒的主要特征之一。

圖7 不同工藝酒樣中37 種揮發(fā)性物質的VIP值Fig. 7 VIP values of 37 volatile components from baijiu samples

圖8 不同工藝酒樣中14 種潛在差異物質的聚類熱圖Fig. 8 Clustering heatmap of 14 potential differential compounds between baijiu samples

以14 種潛在差異物質繪制熱圖并聚類分析（圖8）。相同工藝酒樣聚集在一起，進一步證實所選14 種物質對兩種不同工藝酒樣區(qū)分的有效性。通過-檢驗確定了13 個關鍵差異物質（＜0.01），為糠醛、1,2-丙二醇、正丙醇、乙酸乙酯、仲丁醇、丙酸乙酯、三甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯、乙縮醛、乙偶姻、丙酸、丁酸乙酯、乙酸。

3 結 論

采用GC、GC-MS對不同工藝醬香型酒樣進行定性定量分析，定性分析共鑒定出37 種揮發(fā)性物質；定量分析發(fā)現稛沙酒樣中各類揮發(fā)性物質的質量濃度及所有揮發(fā)性物質的總質量濃度均高于碎沙酒樣，但碎沙酒樣中的酯類、酸類和芳香族化合物占其所有揮發(fā)性物質的相對含量高于稛沙酒樣，說明白酒品質可能與各物質配比相關。兩種酒樣中乙縮醛、乙醛、丁酸乙酯、乙偶姻、戊酸乙酯、辛酸乙酯的OAV均大于100，對酒樣風味產生具有重要貢獻，說明稛沙和碎沙酒樣的風味主要由羰基化合物和酯類產生；稛沙酒樣中糠醛、三甲基吡嗪和丙酸對香氣產生有貢獻，而對碎沙酒樣貢獻不大，說明這3 種物質可能是造成兩種工藝酒樣差異的潛在差異物質。

利用PCA和OPLS-DA構建了稛沙酒樣與碎沙酒樣的鑒別模型，并隨機選擇30 個酒樣作為測試集對模型進行驗證，總體正確率為93.33%，模型良好，可以基本實現兩種工藝酒樣的鑒別。9 種不同比例混合酒樣在模型中的分配結果和分布情況表明，該鑒別模型不僅能應用于稛沙和碎沙酒樣的分類，還可用于混合酒樣的初步識別。VIP分析篩選出造成兩種工藝酒樣差異的14 個潛在差異物質（VIP＞1），聚類熱圖分析結果進一步證實了14 種潛在差異物質對區(qū)分兩種不同工藝酒樣的有效性。最終確定了兩種工藝酒樣之間的13 個關鍵差異物質（＜0.01），為糠醛、1,2-丙二醇、正丙醇、乙酸乙酯、仲丁醇、丙酸乙酯、三甲基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯、乙縮醛、乙偶姻、丙酸、丁酸乙酯、乙酸。其中，糠醛VIP值最高，同時在兩種酒樣中OAV差異也較大，說明糠醛可能是造成稛沙和碎沙酒樣之間差異的重要物質。

本研究實現了對稛沙酒樣和碎沙酒樣的鑒別，并確定了對差異產生有較大貢獻的揮發(fā)性物質。該鑒別模型與感官鑒別相比更加客觀，使兩種工藝酒樣的鑒別更加高效和準確。稛沙和碎沙酒的準確鑒別對于后續(xù)醬香型成品白酒的勾調以及提升醬香型白酒的品質具有重要意義。目前，對于不同工藝醬香型白酒鑒別的相關研究還處于初級階段，研究結果與結論也需要在后續(xù)探索中進一步驗證，以期為白酒行業(yè)相關領域的發(fā)展提供借鑒。