基于1T-WS2@AuNPs復合材料的白蕓豆酯酶電化學生物傳感器構建及其殺螟硫磷檢測應用

田運霞，吳遠根，王 嘯，季 春，石啟麗，陶 菡,*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學藥學院，貴州 貴陽 550025）

作為現代農業中使用最廣泛的農藥，有機磷農藥（organophosphorus pesticides，OPPs）在保護農作物免受蟲害和提高農作物產量方面發揮著重要作用。不幸的是，由于它在世界范圍內的濫用，對水、土壤甚至農產品造成了嚴重的污染。OPPs進入人體內會引起乙酰膽堿酯酶活性的不可逆抑制，進而導致中樞神經系統的紊亂，甚至威脅生命。因此，開發一種靈敏、快速、可靠和經濟的方法檢測OPPs相當重要。但大多數農藥殘留檢測方法是依賴于大型儀器的實驗室分析技術，這些方法靈敏、準確，可用于高通量檢測，但通常需要復雜的樣品預處理步驟和較長的分析時間，需要訓練有素的操作員。更重要的是，這些儀器價格昂貴，攜帶不方便。這些缺點嚴重限制其廣泛應用。相比之下，電化學傳感檢測技術具操作簡單、檢測迅速、靈敏度高、成本低等優點，非常適合于OPPs殘留的簡便快捷、靈敏可靠檢測。

酶抑制法具有檢測原理簡單、無需大型儀器且易操作等優點，是目前最常用的OPPs快速檢測方法。應用在農藥殘留檢測的酶絕大部分是從動物體內分離純化得到的膽堿酯酶。膽堿酯酶提取步驟繁瑣、價格高昂，極大地增加了檢測成本。有研究發現，植物酯酶對OPPs具有與膽堿酯酶相似的敏感性，其酶活性也可被OPPs抑制，從而可應用于酶抑制法農藥殘留檢測。此外，植物酯酶廣泛存在于植物中，具有提取方法簡單，成本低且易于保存的優勢。因此，以植物酯酶替代膽堿酯酶進行OPPs檢測具有可行性和良好的開發應用價值。

隨著納米技術的飛速發展，納米材料因其獨特的光、電、催化等特性而被廣泛應用于新型高效生物傳感器的開發。在眾多納米材料中，過渡金屬硫族化合物因其比表面積大、優良的電導率和催化性能而受到人們廣泛關注和重視。二硫化鎢（WS）是一種典型的過渡金屬硫族化合物，具有不同電子結構和性質的兩相，分別是1T金屬相和2H半導體相。研究表明，1TWS具有更高的電導率、更強的電荷轉移能力和更高的催化活性位點密度，適合構建酶基電化學生物傳感器。納米金（AuNPs）因其良好的生物相容性而被廣泛用于固定化生物分子以構建生物傳感器，并且AuNPs可以促進電子在電極表面和固定化生物分子活性位點之間的傳遞，通過信號放大提高生物傳感器的靈敏度。此外，AuNPs與1T-WS同時用于構建傳感平臺可實現信號的協同放大，進一步提高傳感器的電化學性能。然而，目前鮮見利用1T-WS構建植物酯酶基電化學傳感平臺的相關研究。

本研究構建來源于白蕓豆的植物酯酶基電化學生物傳感器，利用1T-WS@AuNPs納米復合材料優異的理化性能增敏傳感信號，并對其農藥檢測性能和實際應用性能進行評價。殺螟硫磷檢測原理如圖1所示，蕓豆酯酶（KbE）催化水解底物1-乙酸萘酯（1-naphthyl acetate，1-NA）產生電化學活性物質1-萘酚，當體系中存在農藥殺螟硫磷時，KbE活性會被抑制，導致1-萘酚的產生減少，相應的電化學響應信號也會降低，從而實現殺螟硫磷的定量檢測。

圖1 電化學生物傳感器檢測原理示意圖Fig. 1 Schematic illustration of detection principle for the electrochemical biosensor

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蕓豆、白菜、油菜 貴陽花溪永輝超市；氯化鎢、硫代乙酰胺、,-二甲基甲酰胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨、氯金酸 上海阿拉丁試劑有限公司；殼聚糖（chitosan，CS）（純度90.0%） 北京索萊寶科技有限公司；1-NA、殺螟硫磷標準品 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；AlO打磨粉 上海辰華有限公司。若無特殊說明，實驗用水均為超純水（電阻率18 MΩ·cm），所用試劑均為分析純及以上。

1.2 儀器與設備

CHI660E電化學工作站 上海辰華儀器有限公司；A-10超純水儀 美國Milipore公司；SB-5200 DTD超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；S-3400N透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、SU8010掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立公司；3K18離心機德國Sigma公司；ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、DXRxi顯微拉曼成像光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 KbE的分離純化

參照Bao Jing和Yang Limin等的方法，白蕓豆洗凈晾干后粉碎，稱取適量白蕓豆粉，按照1∶5（g/mL）比例加入蒸餾水，攪拌30 min，4 ℃浸提過夜，5 000 r/min離心10 min取上清液，即得到KbE粗酶液。采用兩步雙水相萃取法對KbE粗酶液進行純化，在聚乙二醇（PEG 1000）與NaHPO組成的雙水相體系中萃取2～3 h后，棄下相，加入(NH)SO進行第二步萃取，2～3 h后收集下相進行透析處理，最后冷凍干燥得到KbE粉末。

1.3.2 AuNPs的制備

參照Das等的方法并稍作修改。將100 mL超純水加熱至沸騰，在劇烈攪拌下迅速加入1 000 μL質量分數4%聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液、800 μL 0.5 mol/L NaOH溶液和400 μL 10 mg/mL的HAuCl溶液。并在劇烈攪拌下持續加熱，直至溶液顏色變成酒紅色并不再改變，停止加熱，繼續攪拌直至溶液冷卻至室溫。將所得AuNPs溶液裝于棕色試劑瓶中，置于4 ℃冰箱保存。

1.3.3 水熱法制備1T-WS

將0.793 2 g的氯化鎢和1.502 6 g硫代乙酰胺溶于60 mL,-二甲基甲酰胺，攪拌溶解1 h，超聲溶解1 h。將上述溶液轉移到反應釜中，200 ℃高溫下反應24 h。反應終止后冷卻至室溫，用無水乙醇和超純水多次洗滌黑色產物，5 000 r/min離心10 min后收集產物，將產物在真空下50 ℃干燥12 h，得到1T-WS納米片。

1.3.4 1T-WS@AuNPs納米復合物的制備

稱取適量1T-WS納米片分散于超純水中，超聲分散30 min，得到1 mg/mL 1T-WS分散液。將1T-WS分散液與AuNPs溶液按一定體積比混合，超聲分散使其充分混勻，得到1T-WS@AuNP納米復合物的分散液。

1.3.5 納米材料的表征

在最優制備條件下，對1T-WS@AuNPs納米復合物及1T-WS納米片進行表征。用SEM和TEM表征樣品的微觀形貌和結構，圖像采集的加速電壓為10 kV和200 kV。用XPS確定樣品的元素組成、元素的化學價態以及相的構成，以Al靶（1 486.6 eV）作為激發光源。用拉曼光譜對樣品的結構進行鑒定，激發波長為532 nm。

1.3.6 修飾電極的制備

對玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）進行預處理，在含有AlO料漿的拋光絨布上打磨數次，依次在丙酮、無水乙醇和超純水中進行超聲清洗，活化后備用。采用滴涂法制備CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極，在潔凈的GCE表面滴涂一定體積的1T-WS@AuNP納米復合物分散液，在紅外燈下烘干后，滴加一定體積的KbE，室溫干燥后在其表面均勻覆蓋一層質量分數為0.25%的CS，干燥后得到CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極。其他修飾電極按照類似方法進行制備，所有酶電極于4 ℃貯存備用。

1.3.7 修飾電極電化學特性測定

以GCE為工作電極，鉑絲電極和Ag/AgCl電極分別為對電極和參比電極，在CHI660E電化學工作站上完成電化學測試。采用循環伏安法（cyclic voltammetry，CV）和電化學交流阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）分別對經最優制備條件得到的裸電極（GCE）、1T-WS/GCE、1T-WS@AuNPs/GCE和CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極進行測定，以表征傳感器組裝過程。5 mmol/L K[Fe(CN)]/K[Fe(CN)]（1∶1，/）為電解質溶液，CV測試電壓范圍為-0.4～0.5 V，掃描速率100 mV/s；EIS測試采用相同的電解質溶液，頻率范圍為1～100 kHz，振幅5 mV。

1.3.8 修飾電極的催化性能測定

將三電極系統浸入含5 mmol/L 1-NA的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液反應體系中，采用方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）在最優條件下測定CS/KbE/GCE、CS/KbE/AuNPs/GCE、CS/KbE/1T-WS/GCE、CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE對1-萘酚的響應電流值。SWV測試電壓范圍為-0.1～0.6 V，振幅25 mV，頻率為15 Hz。

1.3.9 CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極制備及測試條件的優化

采用SWV分別考察磷酸鹽緩沖液pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、1T-WS與AuNPs體積比（0∶1、1∶0、1∶1、2∶1、3∶1）、1T-WS@AuNPs負載體積（6～18 μL）、KbE負載量（0.032～0.23 U）以及農藥抑制時間（5～25 min）對響應電流的影響，優化電極制備參數。

1.3.10 CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的重復性、穩定性及抗干擾性測試

在最優制備條件下，同一批制備5 支修飾電極，并在最優測試條件下分別對同濃度1-NA（5 mmol/L）進行SWV測試。

1.3.11 殺螟硫磷的檢測

在最佳條件下，將所構建CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE用于殺螟硫磷的檢測。將CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE浸入含一定濃度底物（1-NA）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，進行SWV掃描，得到電流響應。電極清洗后，將電極浸入不同濃度的殺螟硫磷標準液中孵化15 min，再次將其浸入含同濃度底物（1-NA）的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，進行SWV掃描得到電流響應。

根據下式計算農藥對酶的抑制率：

式中：為初始電流值；為農藥抑制后電流值。

根據酶抑制率與殺螟硫磷質量濃度呈正比的線性關系，以峰電流值為縱坐標、殺螟硫磷質量濃度為橫坐標構建標準曲線，其中殺螟硫磷質量濃度設置為0.1、1、10 100、200、500、1 000、2 000 μg/L。

1.3.12 CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的實際樣品及回收率測試

根據Kumar等的方法稍作修改，將油菜和白菜清洗凈晾干后，切碎備用。取2 g油菜樣品或白菜樣品于10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，攪拌10 min混勻，8 000 r/min離心10 min，收集上清液備用。

在上清液中分別添加不同質量濃度的殺螟硫磷（5、100、1 000 μg/L）進行實際樣品分析，每組實驗平行測定3 次。基于所構建的標準曲線計算實際樣品體系中的殺螟硫磷含量，考察檢測體系對實際樣品的加標回收率和相對標準偏差。

1.4 數據處理

通過Excel統計并分析實驗數據，利用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 納米材料的表征分析

由圖2A可知，1T-WS呈片狀，并且1T-WS納米片組成了具有大量孔隙的空間結構且結構分布均一。這些空隙一方面能夠增加1T-WS的比表面積，為酶的附著提供更多位點；另一方面也為酶促反應提供了足夠的反應環境，促進反應的進行。圖2B表明，AuNPs是均勻的球形顆粒，平均粒徑為13.5 nm，且較為均勻地附著在1T-WS的片狀表面。

由圖2C可知，1T-WS納米片中含有鎢、硫、氮等元素。從圖2D可知，與2H-WS相比（軟件擬合所得），1T-WS對應的峰向低結合能處偏移了約0.5 eV。同樣，硫元素2p高分辨率譜圖（圖2E）也表現出相似的趨勢，以上峰結合能的變化與相關文獻報道一致，表明本實驗制備的1T-WS納米片中，1T相占主導地位。為進一步確定1T相的存在，采用拉曼光譜對1T-WS納米片的結構進行了鑒定。如圖2F所示，在347 cm和411 cm處有兩個明顯的特征峰，分別對應于WS中面內（E）和層間（A）兩種分子振動模式。此外，在低頻區域出現了幾個新的峰，這文獻報道一致，表明1T-WS制備成功，這與XPS的表征結果也相對應。

圖2 1T-WS2及1T-WS2@AuNPs納米材料的表征Fig. 2 Characterization of 1T-WS2 and 1T-WS2@AuNPs nanomaterials

2.2 不同修飾電極的電化學特性分析

如圖3A所示，4 種電極均出現一對氧化還原峰。與裸電極相比，1T-WS/GCE修飾電極上的氧化和還原峰電流明顯增大；同時，峰電位差從裸電極的173 mV減小到138 mV，這歸因于1T-WS的高導電性。與AuNPs復合后，Fe/Fe電對的氧化和還原電流值進一步增大且峰電位差減小至103 mV，表明1T-WS@AuNPs修飾電極具有更優異的電化學性能，這與AuNPs良好的導電性有關；因此將AuNPs引入1T-WS可以進一步提高電極的導電性，從而加速電子的傳遞。由于KbE和CS為不導電的生物分子，阻礙了電子的傳遞，所以觀察到CS/KbE/1TWS@AuNPs/GCE修飾電極上的氧化還原電流下降且峰電位差增加。

進一步研究不同修飾電極的電化學特性，如圖3B所示，每條曲線都是由高頻區的一個半圓與低頻區的一條直線組成，其中高頻區的半圓直徑大小反映了電極的電荷轉移電阻大小。1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的半圓直徑最小，即電荷轉移電阻最小，表明1T-WS@AuNPs具有優異的電子轉移能力。隨著KbE和CS的進一步修飾固定，半圓直徑明顯增大，CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE的電子轉移能力最差。上述結果與CV測試結果一致，同時表明CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE生物傳感器被成功構建。

圖3 不同修飾電極的CV圖（A）及EIS圖（B）Fig. 3 CV curves (A) and Nyquist plots (B) of different modified electrodes

2.3 不同修飾電極的催化性能分析

由圖4可知，在不含1-NA的磷酸鹽緩沖液中，CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極的SWV曲線平滑，無峰電流響應產生；加入1-NA后，出現一個明顯的氧化峰，說明此峰是由KbE水解1-NA生成的1-萘酚在電極上被電化學氧化而產生。以上結果表明KbE被成功固定在電極上并保持其生物活性。此外，相比于CS/KbE/GCE電極，CS/KbE/1T-WS/GCE、CS/KbE/AuNPs/GCE、CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE修飾電極上所產生的氧化峰電流增大且出峰電位減小。結果表明1T-WS@AuNPs良好的導電性和協同電催化效應有效促進電子的傳遞，從而增強1-萘酚的氧化電流信號，該信號的增強有助于提高傳感器的響應靈敏度。

圖4 不同修飾電極的SWV響應曲線圖Fig. 4 SWV response curves of different modified electrodes

2.4 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE修飾電極制備及測試條件優化

2.4.1 底液pH值的影響

如圖5A所示，隨著pH值的增大，電流響應先增大后減小，在pH 7.0處具有最高電流響應。因此pH 7.0為最優pH值，后續實驗使用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液。

圖5 不同制備條件及測試條件對SWV響應電流及抑制率的影響Fig. 5 Effects of different preparation and test conditions on SWV response current and inhibition rate

2.4.2 1T-WS與AuNPs體積比和1T-WS@AuNPs負載體積的影響

電極修飾材料的組成會影響生物傳感器的電化學性能。如圖5B所示，1T-WS與AuNPs的最佳體積比為1∶1。適量的納米材料修飾到電極上可以增大電極的比表面積，促進電極與電活性物質之間的電子轉移。如圖5C所示，當1T-WS@AuNPs負載體積從6 μL增加到12 μL，峰電流隨負載體積增加而增大，于12 μL時達到最大；當負載體積進一步增加，峰電流值逐漸下降，這可能因為過厚的膜會阻礙電子傳遞。因此，選擇12 μL作為1T-WS@AuNPs納米復合物的最佳負載體積。

2.4.3 負載的KbE酶活力的影響

作為傳感器的生物識別元件，負載的KbE酶活力對響應信號的影響較大。如圖5D所示，隨著負載的KbE酶活力的增加，傳感器的響應電流值變大，在0.13 U時達到最大值；繼續增加負載的KbE酶活力，峰電流值略有下降，這是因為KbE是蛋白酶，導電性很差，過量的酶會阻礙電子在傳感器表面的傳遞。因此，0.13 U為負載的最佳酶活力。

2.4.4 農藥抑制時間的影響

農藥抑制時間的長短會影響檢測的準確性。從圖5E可以看出，隨抑制時間延長，酶活性下降越多，導致生成的1-萘酚越少，抑制率上升；當抑制時間超過15 min時，由于酶活性位點與農藥的飽和結合，酶的抑制程度也趨于穩定。因此，以15 min作為最佳抑制時間。

2.5 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器殺螟硫磷的標準曲線

圖6A表明CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器的峰電流值整體隨著殺螟硫磷質量濃度的增加而減小，農藥對酶活性的抑制逐漸增強。由圖6B可知，在0.1～2 000 μg/L范圍內，抑制率與殺螟硫磷質量濃度（lg）呈良好的線性關系，其線性標準方程為＝14.82lg+24.18，相關系數（）為0.992，檢出限為0.04 μg/L（信噪比為3）。將CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器與已報道的其他檢測方法進行比較（表1），結果表明本研究構建的傳感器具有較寬的線性區間和檢出限；此外，還具有制備簡單、成本低等優點。說明將植物酯酶替代來源于動物的膽堿酯酶進行農藥的高效檢測切實可行，具有進一步開發應用的價值。

圖6 不同質量濃度殺螟硫磷抑制后的SWV曲線圖（A）及殺螟硫磷質量濃度與抑制率的線性關系圖（B）Fig. 6 SWV curves in the presence of different concentrations of fenitrothion (A), and linear relationship between KbE inhibition rate and fenitrothion concentration (B)

表1 殺螟硫磷檢測方法的比較Table 1 Comparison of different methods for fenitrothion detection

2.6 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器重復性、穩定性和抗干擾能力分析

同一批制備5 支修飾電極，分別對同濃度1-NA進行SWV測試，峰電流值相對標準偏差為4.83%。在相同測試條件下，對同一支修飾電極進行連續5 次SWV測試，峰電流值相對標準偏差為3.96%。不用時將傳感器置于4 ℃冰箱貯存，分別測試貯存15 d和30 d的SWV響應，電流響應下降為初始電流的95.9%和80.9%。結果表明所制備的CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器具有良好的重復性和貯存穩定性。

圖7 各干擾物對CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器響應信號的影響Fig. 7 Effects of interfering substances on the response signal of CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE sensor

2.7 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器在實際樣品中應用分析

為了評估所建CS/KbE/1T-WS@AuNPs/GCE傳感器在實際樣品中的應用，將其用于白菜、油菜的加標回收檢測，每組實驗平行測定3 次。如表2所示，回收率為96.16%～109.60%，相對標準偏差小于5%，表明該生物傳感器具有良好的實用性，有望應用于實際樣品中OPPs的檢測。

表2 CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE傳感器在實際樣品中殺螟硫磷檢測Table 2 Rsults of fenitrothion detection in real samples with CS/KbE/1T-WS2@AuNPs/GCE sensor

3 結 論

制備了具有良好電催化活性的1T-WS@AuNPs納米復合物，并以KbE代替乙酰膽堿酯酶構建新型電化學生物傳感器，將其用于殺螟硫磷的簡便、高效檢測。SEM和TEM表征結果表明1T-WS@AuNPs納米復合物具有大比表面積，可為酶的負載提供良好的微環境，同時電化學表征表明1T-WS@AuNPs具有良好的導電性和協同電催化效應可以有效促進電子的傳遞，提高傳感器的響應靈敏度。與傳統分析方法相比，該電化學傳感器成本低、制備簡單、靈敏度高，在OPPs檢測中具有潛在的應用價值，并為植物酯酶在農藥殘留檢測方面的應用提供一定理論和技術基礎。