基于非靶向代謝組學方法探究德昂酸茶與普洱茶（熟茶）之間的成分差異

毛鴻霖，楊 莉，肖 蓉，楊衛星，侯 艷

（1.云南農業大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201；2.普洱學院生物與化學學院，云南 普洱 665000；3.云南農業大學茶學院，云南 昆明 650201）

酸茶，當地人又稱之為“濕茶”或“沽茶”，是云南少數民族茶文化的重要組成部分，也是我國非物質文化遺產之一。酸茶屬于全發酵茶類，通過微生物發酵形成其獨特的品質，味微酸而清香，口感回甜；富含茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿等活性物質，具有提神醒腦、生津止渴、解暑消熱、開胃消食、調節腸道微生物等功能。本課題組的前期研究也發現，德昂酸茶還具有調節腸道微生物、抗肥胖以及防治非酒精性脂肪肝的作用。因此，當地人除將其作為飲料外，還會把它融入到各大菜肴中，形成極具民族特色的食物。

普洱熟茶，屬于后發酵茶，主要產于中國云南省的西雙版納、臨滄、普洱等地區。普洱熟茶具有干茶色澤褐紅、條索肥厚、湯色紅亮、陳香明顯、滋味醇厚回甘、耐沖泡耐貯存的特點，同時通過前人研究可發現，其具有降血脂、抗突變、抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖和抑制毒性等作用，受到眾多茶葉愛好者的青睞，早已成為當地地理標志性產品。而從原料上看，德昂酸茶可以說與普洱熟茶同宗同源，都以云南大葉種茶樹為原料，卻在經過不同的發酵方式過后，形成外觀、口感和色澤差異明顯的兩類茶葉。而目前進行的研究大多都是測定不同茶類樣本中某種特定的物質含量，對茶樣整體代謝物進行比較分析的研究尚少，徐春暉等利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜儀建立一種狗牯腦、廬山云霧茶和婺源綠茶品質鑒別的非靶向代謝組學分析方法。通過對222 個特征差異物進行鑒定，最終鑒定出22 個，主要成分為黃酮類、糖苷衍生物和有機酸類等，為茶葉品質鑒別提供理論依據。解東超等運用液相色譜-質譜進行紫娟烘青綠茶加工過程中花青素變化規律研究，為紫娟綠茶加工工藝的優化提供一定的理論基礎。但鮮見有針對德昂酸茶以及普洱熟茶這2 類云南省特色茶葉之間代謝差異物質的進行非靶向代謝組學研究。

非靶向代謝組學是對生物系統中小分子代謝物進行可靠、系統的定性和定量分析，通過數據整合不僅可以可視化分析樣本差異，還能準確地找出差異代謝物。而常見的代謝組學檢測技術主要為液相色譜-質譜聯用、核磁共振光譜和氣相色譜-質譜。現目前代謝組學技術已被廣泛應用于茶產業的多個環節中，可以用來了解茶葉從種植、加工、飲用過程中內含物質的變化規律，從而揭示茶葉特殊風味的形成原理。林潔鑫等采用感官審評方法及超高效液相色譜-串聯質譜的廣泛靶向代謝組測定方法，對福建省福安市和尤溪縣產的紅茶中的代謝產物進行比較分析。結果表明福安紅茶以“醇和”的滋味特征為主，尤溪紅茶以“甘醇”的滋味特征為主，兩地紅茶的氨基酸和黃酮類物質代謝水平具有顯著差異，可能是形成兩地紅茶滋味品質差異的原因。與其他代謝組學技術相比，超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜具有較好的靈敏度和選擇性，并且單位時間可以掃描多個化合物，通過精確質量數和同位素峰形進行數據庫檢索比對，快速地對目標化合物和未知化合物實現篩查與鑒定。

因此，本研究通過對同種原料不同加工工藝制成的德昂酸茶和普洱熟茶進行非揮發物和代謝物檢測，采用超高效壓液相色譜與-四極桿飛行時間質譜結合非靶向代謝組學技術對德昂酸茶與普洱熟茶的非揮發代謝物進行全面檢測分析，通過獲取代謝物的豐度信息，探究2 類茶葉的主要差異并尋找潛在代謝差異物，以期為2 種茶葉品質形成提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德昂族酸茶（2017年03月）產于云南德鳳茶業有限公司；普洱熟茶（2010年10月）產于云南省普洱茶樹良種場。

福林-酚試劑、甲醇、沒食子酸（相對分子質量188.14）、葡聚糖（葡萄糖）、蒽酮、乙醇、濃硫酸、濃鹽酸、咖啡堿（純度不低于99%）、磷酸緩沖液（pH 8.0）、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、茶氨酸（純度不低于99%）、甲醇、乙腈、醋酸銨、氨水 美國CNW Technologies科技公司；-2-氯苯丙氨酸 上海恒柏生物科技有限公司；所有化學試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設備

DGF30-A電熱鼓風干燥箱 南京試驗儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；1290UHPLC超高效液相色譜儀 美國Agilent科技公司；Triple TOF 5600高分辨質譜儀 美國AB SCIEX有限公司；Heraeus Fresco17離心機 美國Thermo Fisher Scientific科技公司；BSA124S-CW天平美國Sartorius科技公司；JXFSTPRP-24研磨儀 上海凈信科技有限公司；明澈D24 UV純水儀 德國Merck Millipore科技公司；PS-60AL超聲儀 深圳市雷德邦電子有限公司；ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 非揮發物檢測

水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中第一法（103±2）℃恒重法測定；水浸出物含量：參照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》測定；茶多酚含量：參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，采用福林-酚法測定；咖啡堿含量：參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測定》，采用紫外分光光度法測定；游離氨基酸總量：參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量測定》，采用茚三酮比色法測定；茶多糖含量：采用蒽酮-硫酸法測定。

1.3.2 代謝物檢測

1.3.2.1 代謝物提取

稱取德昂族酸茶和普洱熟茶樣本各50 mg，加入1 000 μL含有內標（1 000∶5，/）的提取液（甲醇-乙腈-水，2∶2∶1，/，內標1 mg/mL），渦旋混勻30 s；加入瓷珠，45 Hz研磨儀處理4 min，超聲5 min（冰水浴）；重復步驟2～3 遍；-20 ℃靜置1 h；將樣本4 ℃、12 000 r/min離心15 min；小心地取出500 μL上清液于EP管中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入300 μL提取液（乙腈-水，1∶1，/）復溶；渦旋30 s，冰水浴超聲10 min；將樣本4 ℃、12 000 r/min離心15 min；小心地取出60 μL上清于2 mL進樣瓶上機檢測。各茶葉樣本均有3 個生物學重復。

1.3.2.2 液相色譜分析條件

UPLC BEH Amide色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進樣體積2 μL；流動相洗脫程序見表1。

表1 液相色譜流動相條件Table 1 Mobile phase conditions of HPLC

1.3.2.3 質譜分析條件

AB 5600 Triple TOF質譜儀能夠在控制軟件（Analyst TF 1.7, AB SCIEX）控制下基于數據依賴采集功能進行一級、二級質譜數據采集。在每個數據采集循環中，篩選出強度最強且大于100的分子離子進行采集對應的二級質譜數據。電子轟擊能量30 eV，15 張二級譜圖每50 ms。電噴霧離子源參數設置如下：霧化氣壓60 psi，輔助氣壓60 psi，氣簾氣壓35 psi，溫度650 ℃，噴霧電壓5 000 V（正離子模式）或-4 000 V（負離子模式）。

1.4 數據處理

結果以 ±表示；使用SPSS 21.0軟件進行數據統計分析；使用普洱熟茶oteoWizard軟件將二級質譜原始數據轉成mzXML各式。再使用XCMS做保留時間矯正峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作，同時使用自撰寫R程序包和自建二級質譜數據庫對峰進行物質鑒定。采用R軟件對鑒定的代謝產物進行主成分分析（pcincipal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。根據OPLS-DA模型獲得的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）評分，將VIP值大于1且值小于0.05的代謝物定義為差異代謝物（significant changed metabolites，SCMs），同時將得到的差異代謝物通過代謝通路數據庫京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（www.genome.jp/kegg）進行注釋解析。

2 結果與分析

2.1 德昂酸茶和普洱熟茶基礎成分含量比較分析

表2 德昂酸茶與普洱熟茶基礎成分含量Table 2 Chemcial composition of De’ang sour tea and ripe Pu’er tea%

由表2可知，普洱熟茶與德昂酸茶在水浸出物、茶多糖、咖啡堿、游離氨基酸含量無顯著差異（＞0.05）；在水分、茶多酚含量存在差異，普洱熟茶水分含量顯著高于德昂酸茶，德昂酸茶茶多酚含量顯著高于普洱熟茶（＜0.05）。

2.2 代謝物輪廓分析

在正、負離子模式下，應用上述條件檢測德昂酸茶和普洱熟茶樣品。由圖1可知，德昂酸茶和普洱熟茶中代謝物隨時間的變化規律。同時，可以明顯看出德昂酸茶和普洱熟茶樣品的譜圖中主要化合物的響應值（強度）存在一些差異，其整體的差異主要表現在峰高和峰面積上，綜合分析推測2 種樣品之間的差異可能與化合物水平有關。為了揭示德昂酸茶和普洱熟茶的組分差異，進一步采用多維模式識別，對反映樣本的多個變量進行觀測，以進行較為全面的分析。

圖1 德昂酸茶（A）和普洱熟茶（B）樣本檢測總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatoagrams of De’ang sour tea (A) and ripe Pu’er tea (B) samples

2.3 德昂酸茶與普洱熟茶代謝組學差異分析

2.3.1 PCA

圖2 德昂酸茶組對普洱熟茶組PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot for discrimination between De’ang sour tea (A) and ripe Pu’er tea (B)

2.3.2 OPLS-DA結果

圖3 德昂酸茶組對普洱熟茶組的OPLS-DA得分圖（a）和置換檢驗圖（b）Fig. 3 OPLS-DA score plot (a) and permutation test plot (b) for De’ang sour tea versus ripe Pu’er tea

2.4 德昂酸茶與普洱熟茶差異代謝物分析

基于OPLS-DA結果，根據VIP值大于1且值小于0.05，得到物質的火山圖（圖4），尋找潛在的差異物質。綜合前面的分析結果，得到最終的差異物質，采用聚類熱圖（圖5）對2 種茶葉中差異物質進行分析。如圖5所示，德昂酸茶和普洱熟茶的代謝產物中鑒定出共268 種具有顯著差異的代謝物，占所有鑒定代謝物的63.81%，說明德昂酸茶和普洱熟茶之間的代謝物質差異顯著。在268 種差異代謝成分中，德昂酸茶有78 種成分相對含量顯著高于普洱熟茶，190 種成分相對含量顯著低于普洱熟茶。其中差異倍數較大的是氨基酸類、脂肪酸、核苷酸類、有機酸、糖類5 種類別，分別占比為18.28%、14.55%、13.80%、10.82%、6.71%。在所有差異代謝物中，有機酸11 種、氨基酸類11 種、糖類9 種、脂肪酸9 種、核苷酸類6 種、醇類化合物6 種在德昂酸茶中相對含量更高；氨基酸類38 種、脂肪酸30 種、核苷酸類30 種、有機酸18 種、糖類9 種在普洱熟茶中相對含量更高。雖是同一種原料茶但因發酵工序不同，2 種茶在其種類和含量上的差異，形成了各不相同的滋味特征。

研究結果表明，德昂酸茶中相對含量較高的物質包括麥角硫因、3,4-二甲氧基苯乙酸、3-羥基扁桃酸、氯化乙酰膽堿、2-羥基-4-甲基戊酸、米格列醇、-脯氨酸、4,6-二氧代庚酸、丙二醇、原花青素B、-乙酰甘氨酸。主要為氨基酸、有機酸和酚類物質。在普洱熟茶中相對含量較高的物質包括山柰酚-3-蕓香糖苷、中康酸、-胸苷、非氨酯、肉葉云香堿、芹菜苷、十六碳二酸、異鼠李素。主要有黃酮類、糖類以及核苷酸類等。

麥角硫因是德昂酸茶中差異倍數值最高的物質，高達88.86。其在德昂酸茶的相對定量均值為3.43×10，在普洱熟茶中相對定量均值為3.86×10，麥角硫因是一種稀有的天然氨基酸類強抗氧化劑，由微生物合成，具有調節炎癥，防止紫外線輻射誘導的損傷，保護細胞，預防心血管疾病等作用。目前關于茶葉中麥角硫因研究鮮見報道，其在德昂酸茶中貢獻較大，可能與獨特的發酵方式有關。作為一種天然抗氧化劑具有廣泛的研究前景，在生物體內的作用機制與疾病的關系尚不清楚，仍需進一步的研究探討。

圖4 德昂酸茶組對普洱熟茶組之間化合物的火山圖Fig. 4 Volcano map for differential compounds between De’ang sour tea and ripe Pu’er tea

圖5 德昂酸茶vs普洱熟茶差異代謝物熱圖Fig. 5 Heatmap for differential metabolites between De’ang sour tea and ripe Pu’er tea

發現德昂酸茶與普洱熟茶的有機酸、酚類物質差異代謝物能明顯區分開。德昂酸茶的3,4-二甲氧基苯乙酸、3-羥基扁桃酸、4,6-二氧代庚酸差異倍數值顯著高于普洱熟茶，分別為37.60、19.24、8.81。有機酸是茶葉中一種水溶性化合物，是茶湯香氣和呈味物質的重要成分之一。3-羥基扁桃酸作為一種芳香酸，被用作香精香料的原料之一，推測德昂酸茶具有其獨特的“酸香”，可能與其有機酸的種類和含量有關。在醇類/酚類物質中，米格列醇、丙二醇、原花青素B值顯著差異，分別為12.24、8.23、7.99。米格列醇是一種非天然假糖，已被用作口服降糖劑治療II型糖尿病。丙二醇是一種食品添加劑，常態下為無色黏稠狀液體，近乎無味，細聞發甜，具有保濕、乳化、溶解色素、軟化香精香料的作用。原花青素B是一種天然抗氧化劑，不僅可以清除體內過多的自由基，還能抑制脂質過氧化的發生。這些醇類和酚類的共同作用，使德昂酸茶不僅具有獨特的風味還具有開胃消食、調節腸道微生物等功能。-脯氨酸、乙酰甘氨酸差異倍數值較高，分別為9.62、7.91。說明其對茶葉滋味的貢獻較大，這與前期報道相似，其滋味反映到茶湯中主要表現為鮮爽的口感，對其口感形成扮演著重要角色。

2.5 德昂酸茶與普洱熟茶具有顯著性差異代謝物通路的Metpa分析

通過KEGG數據庫對差異代謝物進行通路富集分析，共檢測有57 條通路（圖6），在鑒定出來的268 種差異顯著的代謝物中，在KEGG中注釋到的個數為164 個，其中有114 個差異代謝物顯著上調，50 個差異代謝物顯著下調，主要分布在47 條代謝途徑中（圖7）。從圖7可發現，普洱熟茶比德昂酸茶的代謝通路更多，更為復雜。而德昂酸茶中，富集程度最高的前5 條通路分別為：1）苯丙氨酸代謝通路（＝0.000 365 18），主要包括-苯丙氨酸化合物、苯基丙酮酸、反式肉桂酸化合物、鄰羥基苯乙酸化合物、4-羥基肉桂酸化合物等差異代謝物；2）VB代謝通路（＝0.679 25），主要包括吡哆醛-5-磷酸化合物等差異代謝物；3）異喹啉生物堿生物合成通路（＝0.109 62），主要包括多巴胺化合物、酪胺化合物等差異代謝物；4）硫胺素代謝通路（＝0.293 34），主要包括-半胱氨酸化合物、磷硫胺化合物等差異代謝物；5）酪氨酸代謝（＝0.254 62），主要包括尿黑酸化合物、對羥基苯乙胺化合物、2-(3,4-二羥基苯基)乙胺化合物等差異代謝物。

由圖7可知，氨基酸類物質參與苯丙氨酸代謝、硫胺素代謝通路、酪氨酸代謝、氨基酸生物合成、氨基糖和核苷酸糖代謝等多條通路，被KEGG注釋到的有21 種，其中有6 種顯著上調，是2 種茶葉的代謝物中重要的部分，對其風味和品質有著密切關系。德昂酸茶中的-色氨酸、-苯丙氨酸、-脯氨酸等都在德昂酸茶中顯著上調。其中，-脯氨酸味微甜；-色氨酸，-苯丙氨酸味微苦，后者屬于芳香族氨基酸，可與糖類起氨基-羰基反應，改善食品的香味。茶葉中的氨基酸種類十分豐富，其含量是決定茶葉滋味濃醇鮮爽的重要因素，發現不同的加工方法對茶的氨基酸含量變化具有一定的影響，德昂酸酸滋味形成主要靠其長達9 個月的微生物發酵，以上這些氨基酸物質的相互作用可能是形成德昂酸茶優良的品質和滋味特征的原因。

圖6 德昂酸茶和普洱熟茶差異物質的代謝通路富集分析Fig. 6 Enrichment analysis of metabolic pathways of differential metabolites in De’ang sour tea versus ripe Pu’er tea

圖7 德昂酸茶（中線右側）和普洱熟茶（中線左側）差異物質的豐度評分分析Fig. 7 Abundance score analysis of differential metabolites in De’ang sour tea versus ripe Pu’er tea

3 討論與結論

本研究結果表明德昂酸茶和普洱熟茶的水浸出物、茶多糖、咖啡堿、游離氨基酸含量上無顯著差異；但在水分和茶多酚之間出現。應用非靶向代謝組學方法對德昂酸茶和普洱熟茶的小分子物質二級質譜數據進行差異性分析。以VIP值大于1且值小于0.05為指標，檢測出17 類268 種顯著性差異代謝產物，占所有代謝物的63.81%，主要包括氨基酸類49 種、脂肪酸39 種、核苷酸類36 種、有機酸29 種、糖類18 種，并發現德昂酸茶中相對含量較高的主要差異代謝物是氨基酸/糖類，普洱熟茶相對含量較高的主要差異代謝物是氨基酸類。通過VIP值和值，進一步篩選到麥角硫因、3,4-二甲氧基苯乙酸、3-羥基扁桃酸、氯化乙酰膽堿、2-羥基-4-甲基戊酸、米格列醇、-脯氨酸、4,6-二氧代庚酸、丙二醇、原花青素B、-乙酰甘氨酸等差異代謝產物對于不同發酵工藝的茶葉不同滋味品質形成可能具有重要貢獻。KEGG代謝通路分析發現，德昂酸茶和普洱熟茶的氨基酸和核苷酸類物質代謝水平具有顯著差異，涉及氨基酸代謝和核苷酸類代謝相關的通路對不同發酵工藝的茶葉的滋味品質有著重要影響。

本研究建立了基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術的非靶向代謝組學方法，該模型可以將德昂酸茶和普洱熟茶彼此區分。對德昂酸茶和普洱熟茶進行鑒定比較，該方法具有良好的重復性和精密度，所檢測到的物質可為德昂酸茶分析及相應的生物學功能研究提供一定的數據支持。