人參、大蒜混合發酵過程中微生物多樣性、成分及抗氧化能力分析

葛長鋅，李雅倩，董微巍，周 鑫，徐孟休，李官浩,*，樸春香,*

（1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；2.青島大學化學化工學院，山東 青島 266000；3.金鄉蒜通天下倉儲有限公司，山東 金鄉 272202）

人參（C. A. Mey）是五加科人參屬的干燥根，是我國名貴中藥材之一，從古至今一直被譽為“百草之王”。其主要活性成分為人參皂苷、多糖、多肽等物質，人參具有抗衰老、抗腫瘤、保護心臟、降血糖以及免疫調節等多種藥理作用。傳統上，常見的人參為白參和紅參，近年來，基于一種新的加工方法開發了新的人參制品——黑參。黑參含有的人參皂苷分型多于人參，提高人參的營養價值，但需要9 次蒸制，加工時間長、消耗大、成本高，限制了其發展和推廣。

大蒜（L.）是世界上最重要的作物之一，通常用于烹飪輔料，除此之外它也具有許多生理功能，如抗氧化性、抗菌性、抗癌性以及預防心血管疾病等。但是由于大蒜具有很強的刺激性氣味和辛辣味，因此，近年來，研究人員通過各種處理方法，例如熱處理、陳化和發酵等，以消除其刺激性氣味并改善大蒜的適口性。因此，大蒜發酵產品黑蒜得以誕生。黑蒜是將整個大蒜鱗莖在高溫控濕條件下加工而制得的產品，因其味道酸甜、質地柔軟、營養成分豐富以及具有多種健康特性而在世界范圍內廣受歡迎。

人參和大蒜都具有多種生物活性物質，具有較好的藥用和食用價值，且近年來都發展出了高溫加工制品黑參和黑蒜。但由于人參產量低、價格高，限制了黑參產業的發展；而大蒜不僅種植面積廣、產量高，且價格便宜。此外，有研究表明黑參與黑蒜復配使用可顯著促進肝癌HepG-2細胞凋亡，對提高黑參的抗癌作用具有促進作用。因此，本實驗通過比較人參發酵、大蒜發酵及人參和大蒜混合發酵產物的微生物群落變化、成分變化以及抗氧化活性變化，研究大蒜對黑參發酵的促進作用，旨在為降低黑參制作成本、促進黑參產業的發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜、人參 市售；無水乙醇、甲醛、氫氧化鈉、無水碳酸鈉（均為分析純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 日本和光純藥工業株式會社；2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 北京酷爾化學科技有限公司；5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF） 北京索萊寶科技有限公司；過硫酸鉀 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；沒食子酸（分析純）、福林-酚 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52AA旋轉蒸發儀 上海豫明儀器有限公司；Synergy H1酶標儀 美國BioTek公司；LC-2030液相色譜儀 日本島津公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海凌科實業發展有限公司；T6新世紀紫外分光光度計 上海普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

黑參、黑蒜發酵：參考于蒙娜液態發酵黑蒜方法并加以修改，取人參和新鮮剝皮大蒜，研磨成泥，分別取10 g參泥和蒜泥加入4 mL蒸餾水，放入自封袋中，于75 ℃條件下進行液態發酵，共發酵26 d。發酵期間每隔2 d取一次樣，置于-80 ℃冰箱中備用。

人參和大蒜混合發酵（參蒜）：在進行預實驗的前提下，以人參、大蒜1∶1為混合比例，按照上述方法進行發酵和取樣。

提取液的制備：稱取適量樣品于錐形瓶中，以料液比1∶20（g/mL）加入60%乙醇溶液，在40 ℃、600 W超聲條件下提取30 min，提取液抽濾澄清后于50 ℃條件下旋轉蒸發至原體積的1/3，冷凍干燥備用。

1.3.2 樣品DNA提取及擴增

使用MN NucleoSpin 96 Soi試劑盒進行微生物群落總DNA提取，擴增引物為F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），擴增程序：95 ℃預變性5 min，25 個循環（95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），然后72 ℃穩定延伸7 min，最后在4 ℃進行保存。

1.3.3 Illumina Novaseq測序

使用Illumina Novaseq 6000，分別對細菌16S rRNA V3-V4高變區序列進行測序分析。

1.3.4 成分分析

還原糖含量借鑒于蒙娜的方法，以葡萄糖為標準；總酚含量采用福林-酚法，以沒食子酸為標準，結果以沒食子酸當量（mg/g）表示；總酸含量測定采用GB/T 12456—2021《食品中總酸的測定》；5-HMF含量的測定采用GB/T 18932.18—2003《蜂蜜中羥甲基糠醛含量的測定方法 液相色譜-紫外檢測法》。

1.3.5 人參皂苷含量測定

參考房柳等的方法并加以修改，發酵產物經水飽和正丁醇3 倍體積萃取，5 000 r/min離心5 min，取上清液，反復3 次；將萃取出的萃取液旋轉蒸發至膏狀，加入1 mL色譜甲醇，轉移至液相瓶內，使用高效液相色譜儀進行分析。

檢測條件：色譜柱為ZORBAX SB-C柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流速0.8 mL/min；流動相為乙腈（A）、水（B），洗脫程序見表1；檢測波長203 nm；進樣量15 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.6 抗氧化能力測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除率

參照Ren Feiyue等的方法并適當調整。吸取25 μL樣液于96 孔板中，加入200 μL DPPH溶液（100 μmol/L），室溫避光30 min。然后通過酶標儀測定在517 nm波長處的吸光度。使用200 μL乙醇溶液代替DPPH溶液作為空白樣品組。以25 μL乙醇溶液和200 μL DPPH作為對照組，225 μL乙醇溶液作為空白組。所有實驗進行3 組平行，按照式（1）計算DPPH自由基清除率：

式中：為樣品組吸光度；為空白樣品吸光度；為對照組吸光度；為空白組吸光度。

1.3.6.2 ABTS陽離子自由基清除率

參考Xie Xiaolin等的方法。將7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀在室溫條件下避光反應12～16 h，制得ABTS儲備液。用磷酸鹽緩沖液將ABTS溶液稀釋至為2.0±0.1，制得ABTS工作液。吸取25 μL提取液于96 孔板中，加入200 μL ABTS工作液，避光靜置8 min，然后在734 nm波長處測定吸光度。以200 μL磷酸鹽緩沖液代替ABTS工作液作空白樣品組。以25 μL磷酸鹽緩沖液和200 μL ABTS工作液作為對照組，以225 μL磷酸鹽緩沖液作為空白組。所有實驗進行3 組平行，按照式（2）計算ABTS陽離子自由基清除率：

式中：為樣品組吸光度；為空白樣品吸光度；為對照組吸光度；為空白組吸光度。

1.4 數據統計分析

使用Excel 2016和SPSS 24.0軟件進行數據計算和分析，采用Duncan分析，＜0.05，差異顯著。基于Illumina-MiSeq測序平臺，使用BMKCloud進行微生物群落結構分析。

2 結果與分析

2.1 微生物多樣性分析

2.1.1多樣性分析

多樣性反映單個樣品物種豐度及物種多樣性，有多種衡量指標。ACE指數和Chao1指數衡量物種豐度即物種數量的多少。相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認為群落具有越大的多樣性，Shannon指數和Simpson指數越大，說明樣品的物種多樣性越高。

表2 發酵過程中微生物菌群的α多樣性Table 2 α-Diversity indices of microbial flora during fermentation

各個樣品質量控制后，在16S rRNA序列中分別得到73 487、65 085、65 825、45 853、66 986、60 803、68 265 條有效序列?；诳刹僮鞣诸悊卧╫perational taxonomic units，OTU）數的稀釋曲線和Shannon曲線趨于平緩（圖1），表明本研究的測序深度足以代表樣品的微生物結構，說明測序數據足夠后續分析。此外，分別以ACE、Chao1、Simpson指數和Shannon指數等參數描述不同時期樣品中微生物群落的豐度和多樣性（表2）。在發酵過程中樣品的微生物群落豐富度呈現先上升后下降趨勢并在第8～12天達到峰值，隨著發酵的進行，Simpson指數趨于穩定，Shannon指數逐漸上升并且在第20天達到峰值，說明在發酵第20天時，參蒜發酵產物的微生物群落多樣性最高。

圖1 各樣品微生物的稀釋曲線（A）和Shannon曲線（B）Fig. 1 Rarefraction curves (A) and Shannon curves (B) of microorganisms in each sample

2.1.2 微生物群落結構分析

根據OTU分析結果，對樣品數據在門和屬水平上進行分類學分析。在門水平上，共檢測出34 個門，為了簡化圖表，只顯示豐度前20的門。其中豐度排名前10的門分別為Epsilonbacteraeota、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍藻細菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）。以上10 種菌門的相對豐度在樣品中達到95%以上，表明在門水平上參蒜發酵過程中微生物菌群結構具有明顯的穩定性。

由圖2可以看出，在第0天，人參和大蒜的優勢菌門為藍藻細菌門和變形菌門，隨著加工時間的推移，其微生物群落結構發生顯著改變，各個發酵時期厚壁菌門微生物豐度顯著增加，而藍藻細菌門豐度顯著下降，發酵20 d后微生物豐富最高的為厚壁菌門26.09%，其次為變形菌門23.49%；因此，可以看出人參、大蒜以及參蒜的微生物群落組成具有明顯差異，在參蒜中第1優勢菌門由藍藻細菌門轉變為厚壁菌門，其原因可能是隨著高溫發酵時間的延長，不利于大多數抗逆性較差的微生物生長，而厚壁菌門的微生物抗逆性強能夠適應高溫環境，從而成為優勢菌門。

圖2 混合發酵樣品微生物群落結構（門水平）Fig. 2 Microbial community structure of co-fermented samples at phylum level

圖3 混合發酵樣品微生物群落結構（屬水平）Fig. 3 Microbial community structure of co-fermented samples at genus level

由圖3可知，混合發酵后樣品與人參和大蒜在屬水平上存在較大的差異。所有樣品共檢測到699 個屬，圖中只顯示了相對豐度前20的屬，并將其他物種合并為others在圖中顯示。其中，參蒜的優勢菌屬為uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae、uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae、擬桿菌屬（）、uncultured_bacterium_o_Subgroup_2、乳桿菌屬（）、uncultured_bacterium_o_Acidobacteriales和uncultured_bacterium_c_Subgroup_6；在人參和大蒜中，第一優勢菌屬分別為Aegypius_monachus_black_vulture和uncultured_bacterium_o_Chloroplast，在整個發酵過程中這兩種屬的豐度逐漸降低，在第20天時其豐度分別為0.08%和0.90%；在發酵后期，參蒜中的第一優勢菌屬為uncultured_bacterium_f_Lachnospiraceae，它是一種目前還不能進行實驗室培養的菌屬，其菌種特性和生理功能還有待進一步研究；此外，隨著發酵時間的延長乳桿菌屬相對豐度逐漸增加并成為優勢菌屬，最終相對豐度為2.78%；乳桿菌屬微生物是常見的益生菌，具有抑制病原菌的生長、增強機體免疫功能以及產生有機酸等功能，因此乳酸桿菌屬的大量生長可以抑制其他病原微生物的生長繁殖，同時其產生的有機酸還可以起到改善發酵產物風味的作用。

2.1.3 參蒜混合發酵微生物群落代謝功能比較分析

通過比較人參、大蒜以及不同發酵階段參蒜的京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代謝通路數據，可以分析出它們的微生物群落代謝差異。所有樣品共形成6 條一級代謝通路以及44 條二級代謝通路，6 大類一級代謝通路分別為代謝通路、遺傳信息處理、環境信息處理、細胞過程、人類疾病以及生命系統。由圖4可知，各樣品中全局及概要圖代謝通路的豐度最高，該通路與基礎代謝有關，其豐富越高表明微生物代謝活性越強，有利于發酵過程中營養和活性物質的形成與轉化。其次，碳水化合物代謝的豐度也較高，三羧酸循環、丙酮酸代謝、磷酸戊糖和糖酵解途徑等是碳水化合物的主要代謝途徑，這些代謝會產生大量的有機酸如檸檬酸、乙酸、丁酸等，使得參蒜的pH值逐漸降低，從而抑制其他雜菌生長，上述有機酸的產生還可能對參蒜的風味產生影響，促進其酸甜口味的形成，此外，乳酸菌在糖代謝過程中除了正型乳酸發酵產生乳酸外，還會異型乳酸發酵產生乙醛、丙酮等揮發性芳香化合物，能促進參蒜香味的形成；而其他與食品風味物質形成相關的代謝途徑（氨基酸代謝、脂代謝、輔助因子和維生素代謝）在各個時期代謝通路豐度比值也較高且稍有變化，氨基酸代謝能將大分子蛋白降解成容易被身體吸收的氨基酸或肽類物質，其中一些代謝物可能具有抗菌活性和抗腫瘤活性，大大提高了產品的生理功能；通過脂質代謝通路，脂肪被分解為游離脂肪酸，再進一步代謝形成醛等揮發性風味物質，促進最終產品風味的形成。

圖4 混合發酵過程中各樣品基因KEGG代謝通路分析Fig. 4 KEGG metabolic pathway analysis of genes in each sample during co-fermentation

2.2 不同發酵樣品成分分析

2.2.1 還原糖含量

大蒜中的碳水化合物主要由果聚糖組成，人參中也含有大量多糖，主要為中性糖和酸性果膠，發酵過程中，高溫加熱直接導致多糖降解，從而導致還原糖含量顯著上升。由圖5可知，隨著發酵時間的延長黑蒜中還原糖含量逐漸升高，在第20天達到峰值后下降，第24天還原糖含量為89.63 mg/g；人參單獨發酵后還原糖含量緩慢上升，12 d后趨于平穩，第24天含量為55.39 mg/g；人參與大蒜1∶1混合發酵后還原糖含量顯著上升，并于第24天達到最高值161.60 mg/g；實驗表明，黑參的還原糖含量最低，但人參與大蒜混合發酵后可顯著提高其還原糖含量，含量越高甜味越大，有助于改善黑參風味。

圖5 不同發酵時間還原糖含量的比較Fig. 5 Comparison of reducing sugar contents at different fermentation times

2.2.2 總酸含量

總酸含量是評判黑蒜風味的指標之一，當總酸含量在15～40 mg/g范圍內時，酸味適中，風味佳；但是當其超過40 mg/g時，其酸味過重，口感差。從圖6可以看出，隨著發酵的進行，黑蒜、黑參和參蒜總酸含量均呈現上升趨勢，最終總酸含量依次為23.33、38.33 mg/g和33.33 mg/g。實驗表明，黑參酸度最高，與參蒜的總酸含量差異不顯著，黑蒜總酸含量顯著低于黑參和參蒜；三者的總酸含量都在15～40 mg/g之間，說明他們的酸味都比較適中，風味較好。因此，大蒜和人參混合發酵并不會顯著改變產品的總酸含量，對其酸味不會造成影響。

圖6 不同發酵時間總酸含量的比較Fig. 6 Comparison of total acid contents at different fermentation times

2.2.3 總酚含量

多酚類物質是具有潛在促進保健作用的植物性化合物，并且其抗氧化作用可防止一些慢性病的發生，具有潛在的促進健康的作用。由圖7可知，隨著發酵時間的延長，黑蒜、黑參以及參蒜的總酚含量均顯著提高，最終含量分別為2.55、2.11 mg/g和2.61 mg/g，總酚含量分別提高了4.64、11.72 倍和8.42 倍，總酚含量上升的主要原因是大分子化合物分解釋放出較多酚羥基。實驗表明，黑參的總酚含量最低，但在加入大蒜混合發酵后可顯著提高其總酚含量，有利于多酚類物質的積累，多酚類物質含量越高，其保健功效越好。

圖7 不同發酵時間總酚含量的比較Fig. 7 Comparison of total phenol contents at different fermentation times

2.2.4 5-HMF含量

5-HMF是美拉德反應的中間產物，在面包、餅干等食品中較為常見，含量高時可表現出毒性。根據圖8可知，5-HMF的出峰時間為10.776 min，通過保留時間進行定性；對黑蒜、黑參和參蒜的5-HMF含量進行分析，其保留時間分別為10.596、10.576 min和10.434 min，與標準品出峰時間一致，可判定為5-HMF；根據標準曲線進行含量計算，黑蒜、黑參和參蒜的5-HMF含量分別為（96±0.19）、（145±0.35）、（109±3.70）μg/g。實驗結果表明，人參單獨發酵時其5-HMF含量顯著高于黑蒜和參蒜。因此，采用人參和大蒜混合發酵可顯著降低生產過程中潛在有害物質5-HMF的形成，提高其食用安全性。

圖8 5-HMF標準溶液液相色譜圖Fig. 8 Liquid chromatogram of 5-HMF standard solution

2.3 黑參和參蒜人參皂苷含量對比

目前，從人參等中藥中分離鑒定出的人參皂苷有100余種，其中人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1占總人參皂苷的90%以上，被認為是主要的人參皂苷；研究發現，人參皂苷的次級代謝產物具有更強的生物活性，通常被稱為稀有人參皂苷，并且人體胃腸道對主要人參皂苷的吸收非常差，而稀有人參皂苷更容易被人體吸收并發揮作用；因此，促進主要人參皂苷轉化為稀有人參皂苷是提高黑參營養價值和功能性的有效手段。

通過液相色譜法對黑參和參蒜發酵過程中各人參皂苷含量進行測定，結果圖9所示。隨著發酵過程的進行，Re、Rg1、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rg2等主要人參皂苷含量逐漸下降，Rg3、Rh2等稀有人參皂苷的含量逐漸上升，說明在發酵過程中主要人參皂苷逐漸轉化為功能活性更強的稀有人參皂苷；在第0天時，添加大蒜組的主要人參皂苷含量低于人參組，從第6天開始參蒜組的稀有人參皂苷含量高于黑參組，同時發酵結束后參蒜稀有人參皂苷轉化率為61.65%，顯著高于黑參組的24.29%。因此，大蒜與人參混合發酵有助于提高稀有人參皂苷的轉化率，對提高黑參的營養價值和生理功能具有促進作用，但加入大蒜后轉化率顯著提高的作用機制還有待進一步研究。

圖9 人參和參蒜發酵過程中皂苷含量變化Fig. 9 Changes in saponins contents in ginseng and ginseng garlic during fermentation

2.4 不同樣品抗氧化能力比較

2.4.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩定的自由基，顏色呈紫紅色，在517 nm波長下有強吸收。當體系中存在抗氧化物質時會與其孤對電子配對，吸收將減弱或消失，而吸收減弱的程度則可以反映自由基清除物質的活性。如圖10所示，隨著發酵時間的延長，黑蒜、黑參和參蒜的DPPH自由基清除能力均呈現上升趨勢，發酵結束后DPPH自由基清除率分別達到了53.29%、58.10%和56.61%，但三者之間無顯著差異，說明混合發酵能對黑蒜、黑參本身的抗氧化活性無顯著影響，能很好地保持其抗氧化能力；發酵后抗氧化能力的提升可能得益于總酚含量的上升以及Amadori化合物的產生；此外，人參中含有的多糖類物質也具有很好的抗氧化活性，發酵過程中由于黑參中還原糖含量變化較小，說明其多糖分解較少，因此，人參多糖也可能對黑參抗氧化能力的提高起促進作用。

圖10 不同發酵時間DPPH自由基清除率的比較Fig. 10 Comparison of DPPH radical scavenging capacity at different fermentation times

2.4.2 ABTS陽離子自由基清除率

從圖11可以看出，不同發酵階段樣品的ABTS陽離子自由基清除能力隨時間延長而上升，發酵結束后黑蒜、黑參和參蒜的ABTS陽離子自由基清除率分別達到了74.65%、90.34%和90.32%。結果表明，黑參和參蒜的ABTS陽離子自由基清除能力無顯著差異，并且顯著優于黑蒜。

圖11 不同發酵時間ABTS陽離子自由基清除率的比較Fig. 11 Comparison of ABTS radical cation scavenging capacity at different fermentation times

3 結 論

通過液態發酵法分別制備黑蒜、黑參和參蒜并對其微生物多樣性、主要成分及抗氧化能力進行比較。微生物多樣性分析表明，所有樣品共檢測出34 個門和699 個屬，參蒜的第1優勢菌屬為uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae，乳桿菌屬也是優勢菌屬之一，并對其風味具有一定影響；結合KEGG代謝通路分析，參蒜與大蒜和人參的代謝通路無明顯差異，豐度最高的全局及概要圖、碳水化合物代謝和氨基酸代謝對參蒜發酵過程中的成分變化及風味形成具有貢獻；成分分析結果顯示，參蒜的還原糖和總酚含量顯著高于黑參，總酸含量與黑參無顯著差異，潛在有害物質5-HMF含量顯著降低；此外，混合發酵后稀有人參皂苷轉化率顯著提高；在抗氧化方面，有研究表明黑蒜和黑參均具有良好的抗氧化能力，而參蒜的DPPH自由基清除能力與黑蒜、黑參無顯著差異且ABTS陽離子自由基清除能力顯著優于黑蒜，表明參蒜具有良好的抗氧化功能。

上述實驗結果表明，傳統的九蒸九制黑參制備方法過于繁瑣，而液態發酵法不僅操作簡單，還有利于黑參營養價值和生理功能。因此，參蒜是一種值得開發和研究的新型保健食品，在后續研究中應進一步優化參蒜發酵工藝，應用到工業化的生產當中，為促進黑參產業的發展提供理論依據。