葡萄酵素發酵過程中代謝產物的動態變化

王印壯，段定定，丁玉峰，馬艷莉,,*，牟建樓,*，席曉麗，谷曉東，宋乾華

（1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000；2.南陽理工學院張仲景國醫國藥學院，河南 南陽 473000）

食用植物酵素起源于日本，已有上百年歷史，20世紀初進入我國市場。已有研究表明，食用植物酵素富含多種生理活性物質，具有抗氧化、調節免疫以及解酒護肝等功效。隨著人們健康意識的提高，大眾對食用植物酵素產品的關注度越來越高。根據我國工業和信息化部制定的QB/T 5323—2018《植物酵素》標準，食用植物酵素是指以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經微生物發酵制得的含有特定生物活性成分可供人類使用的酵素產品。在其制備工藝中起關鍵作用的是各種微生物，通過微生物的發酵作用將原料中的物質進行轉化，形成代謝產物釋放于酵素之中，使其具有豐富的風味物質，并且在發酵過程中產生的各種生理活性物質以及發酵微生物大多為益生菌，從而又使其具有功能性。目前，市場上的酵素產品多以自然發酵生產，發酵過程不易控制，易染雜菌且發酵時間較長，不易滿足日益擴大的市場需求和實現大規模工業化生產，因此，條件可控且穩定的接種發酵技術得到發展。莫大美等以玫瑰花為原料，接種酵母、乳酸菌和巴氏醋桿菌發酵制備酵素，研制出一種具有玫瑰花色澤和香氣、口感極佳、超氧化物歧化酶活性高的玫瑰花酵素產品。洪厚勝等以葡萄果渣、糖蜜等為原料，采用響應面法，優化接種酵母菌、醋酸菌以及乳酸菌發酵酵素工藝，生產出富含多種有機酸、香氣成分以及色澤亮麗、口感、滋味均佳的酵素產品。在利用接種發酵技術制備酵素時，研究發酵過程中代謝產物的動態變化規律，對酵素產品的品質提升及發酵終點的判定具有重要意義。陳英等以蔬菜、水果、菌類等為原料，接種酵母菌、乳酸菌和醋酸菌發酵制備酵素，對發酵過程中微生物的數量、理化指標及揮發性成分進行了監測和分析，得出發酵過程中的物質變化規律，為其實現大規模工業化深層發酵生產以及優化產品品質提供了技術參考和理論依據。

葡萄富含多種營養物質，是世界上栽培面積最大、產量第二的水果，但其季節性較強、貯存期較短，采后需及時進行深加工。因此，本研究以葡萄為原料，采用依次接種酵母菌、醋酸菌及乳酸菌的接種發酵技術，分析發酵過程中總酸、有機酸、乙醇體積分數、總酚、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及-葡萄糖苷酶活力、揮發性風味成分等的動態變化規律，以期為實現葡萄酵素的工業化生產、綜合性開發以及品質的提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與試劑

夏黑葡萄（Summer Black）來自河南省南陽市社旗縣；釀酒酵母XQ-05來自河南省工業微生物菌種保藏中心；巴氏醋桿菌CGMCC 1.41、植物乳桿菌ACCC 11095來自北京生物保藏中心。

果膠酶（酶活力500 U/mg） 諾維信有限公司；MRS肉湯（乳酸菌通用培養基，生物試劑） 北京奧博星生物技術公司；0.45 μm聚偏氟乙烯中空纖維微濾膜天津愛生膜公司；檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸（色譜級） 美國Sigma公司；沒食子酸（分析純）天津科密歐公司；磷酸（色譜級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚、對硝基苯酚（色譜級） 上海科密歐公司；福林-酚（分析純） 上海麥克林試劑公司。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母浸出粉10 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min（固體培養基再加入1.5%瓊脂粉）。

許氏醋酸菌種子培養基：葡萄糖5 g，酵母浸出粉5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入30 mL無水乙醇。

1.2 儀器與設備

GC-7890氣相色譜儀、7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、1260高效液相色譜儀 美國Agilent儀器有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supelco公司；AL-04電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-752N紫外-可見分光光度計上海精密科學儀器有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋金壇市晶玻實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酵素制備

挑選新鮮無損壞的葡萄，洗凈、晾干、打漿后放入已滅菌的玻璃罐中，添加紅糖至糖度為18 °Brix，利用75 mg/mL酶活力500 U/mg的果膠酶于50 ℃酶解40 min，之后100 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫，得到發酵基質，測定其還原糖質量濃度（31.91±5.14）g/L，pH 3.77±0.01。

將保藏于甘油管中的3 株菌，分別取20 μL于不同固體培養基中，待長出單菌落后接種于相應的液體培養基（酵母菌為YEPD培養基、醋酸菌為許氏醋酸菌種子培養基、乳酸菌為MRS肉湯）中活化，得不同菌株活化液，濃度大于10CFU/mL。以3%（/）接種量將不同菌株活化液接種于相應的液體培養基中搖床培養制備發酵菌液，酵母菌于28 ℃、150 r/min搖床培養14 h，巴氏醋桿菌于30 ℃、180 r/min搖床培養48 h，植物乳桿菌于37 ℃、200 r/min搖床培養22 h。

首先，接入發酵基質體積3%酵母菌液，常溫避光發酵6 d；再接入發酵基質體積5%醋酸菌液，至第27天；采用4 層無菌紗布過濾去渣，而后利用0.45 μm的中空纖維微濾膜過濾除菌；最后接種發酵基質體積的3%乳酸菌液，發酵至第41天。分別于第0、3、6、13、20、27、34、41天平行取樣3 次。為避免雜菌污染，以上所有操作均在無菌室中進行。

1.3.2 總酸含量的測定

參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定》中的方法。

1.3.3 有機酸含量的測定

將2.5 mL樣品與1 mL 10.6%的KFe(CN)·3HO、1 mL 30.0%的ZnSO溶液混合，用去離子水定容至50 mL，反應30 min后取上清液離心，再經0.45 μm膜和C柱過濾。檢測條件：色譜柱Eclipse XDB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），進樣量10 μL，流速0.9 mL/min，流動相0.02 mol/L磷酸二氫鈉（磷酸調pH 2.1），柱溫30 ℃，檢測器二極管陣列檢測器，檢測波長210 nm。

1.3.4 乙醇體積分數的測定

參照陳玉香等的氣相色譜法。

1.3.5 總酚含量的測定

采用福林-酚方法測定。其標準曲線回歸方程及相關系數為＝0.001 1-0.001 9，＝0.998 9。

1.3.6 SOD及-葡萄糖苷酶活力的測定

-葡萄糖苷酶活力測定參照侯曉瑞的方法；SOD活力測定參照GB/T 5009.171—2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定》中的鄰苯三酚自氧化法。

1.3.7 揮發性風味成分測定

將7.5 mL樣品、1 g NaCl和25 μL 300 μg/mL的3-辛醇添加到20 mL頂空瓶中，置于40 ℃水浴鍋中平衡15 min，將固相微萃取纖維頭插入頂空瓶中萃取吸附40 min后，放入氣相色譜進樣器中解吸6 min。檢測條件：色譜柱為HP-INNOWax毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；烘箱升溫程序為50 ℃保持2 min，以3 ℃/min升溫至80 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min；注射器溫度240 ℃；載氣（氦氣）流量1.45 mL/min，分流比5∶1；離子源和質譜傳輸線溫度分別為240 ℃和250 ℃，電子能量為70 eV，質量范圍為/33～550。

利用氣相色譜-質譜中美國國家標準與技術研究所發布的NIST14.L質譜數據庫結合保留時間，對匹配度≥80的香氣物質進行定性分析；以已知濃度的3-辛醇為內標物，采用內標法，通過樣品中各揮發性風味成分與內標物3-辛醇峰面積比值進行定量。

1.4 數據處理

數據均采用 ±表示，利用軟件IBM SPSS Statistics 26對數據進行單因素方差分析（＜0.05）以及最小顯著差數法、Duncan多重比較分析，利用軟件Origin 2019繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 葡萄酵素發酵過程中總酸及檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸的變化

酵素發酵中伴隨著各種生物化學反應以及微生物活動等過程，酸類物質是該過程中重要的代謝產物，其中總酸度可反映出食用植物酵素的成熟度以及質量品質，而有機酸則可賦予酵素獨特的風味，其不僅是發酵代謝產物，還可作為發酵環境中微生物的碳源和電子供體，其種類和數量在發酵過程會發生變化。由表1、圖1可知，接種酵母菌發酵期間（0～6 d），總酸含量顯著升高（＜0.05），檸檬酸、蘋果酸、酒石酸含量增多，而乙酸則未檢出。研究發現葡萄中有機酸主要以檸檬酸、蘋果酸和酒石酸為主，乙酸含量少，幾乎檢測不出。因此表明該階段主要為酵母菌的發酵作用將葡萄基質中的有機酸進一步溶出并且通過糖代謝積累代謝產物。接種醋酸菌后（6～27 d），由于醋酸菌適應基質較為緩慢，發酵前7 d總酸含量變化不顯著（＞0.05），而后發酵13～27 d含量急劇升高，這是因為醋酸菌適應基質后將酵母菌發酵產生的大量乙醇轉化為乙酸，大幅提高了總酸含量（圖1）。但該階段乳酸含量逐漸降低，Elferink等研究發現乳酸含量降低與乙酸的積累相關，因此，這可能與葡萄酵素發酵過程中乙酸積累有關。接種乳酸菌后（27～41 d），總酸含量繼續升高并于34 d達到最大值，而后略微降低。陳小偉等在探究草莓酵素發酵過程中總酸含量的變化時，發現發酵前75 d總酸含量不斷增加至78.98 mg/mL，而后略微降低，這主要是由于總酸的累積，影響了發酵菌株的繁殖與代謝，而且后期主要是接種乳酸菌發酵，故多元酸的持續降解會導致酸度略微下降，并且發酵后期，基質中糖類含量減少，有機酸也可能作為微生物的替代碳源而被消耗。乳酸、檸檬酸質量濃度在乳酸菌發酵期間（27～41 d）逐漸增加至最大值102.09 mg/L和67.70 mg/L，而蘋果酸減少至0，這可能是因為乳酸菌通過三羧酸循環、蘋果酸發酵等途徑，將蘋果酸轉化為檸檬酸、乳酸等所致。在葡萄酵素接種發酵的3 個階段中，醋酸菌發酵階段（6～27 d）對總酸和有機酸含量的增加貢獻最大，并且該階段主要產生醋酸，其發酵結束時醋酸質量濃度達到（3 127.80±2.36）mg/L。研究表明，發酵中產生適量的醋酸可提高酵素產品的營養及風味，還可抑制腐敗微生物生長，但當酸度過高時，則會對酵素產品的風味造成負面影響。何翠嬋在研究微生物對青梅汁酸度的降低作用時發現，利用植物乳桿菌能夠實現有效降酸，并且發酵后期由于基質糖濃度的降低，有機酸也可被微生物作為替代碳源利用，這與本研究在接種乳酸菌發酵后期，總酸以及有機酸含量有所降低一致。因此，在接種乳酸菌發酵（27～41 d）期間，其不僅可以起到提高產品營養成分和功能的作用，還可改善酵素風味，使得產品更加柔和協調。

表1 葡萄酵素發酵過程中總酸含量的變化Table 1 Changes of total acid content during fermentation of grape Jiaosu

圖1 葡萄酵素發酵過程中檸檬酸、乳酸、乙酸、蘋果酸、酒石酸含量的變化Fig. 1 Changes of citric acid, lactic acid, acetic acid, malic acid,tartaric acid contents during fermentation of grape Jiaosu

2.2 葡萄酵素發酵過程中乙醇含量的變化

酵母菌在發酵葡萄酵素過程中，會發生糖代謝生成乙醇等代謝產物，其含量會影響產品風味和質量，是食用植物酵素的基本理化指標。由表2可知，在接種酵母菌（0～6 d）發酵過程中，乙醇含量顯著增加（＜0.05）；而后接種醋酸菌（6～27 d）發酵時并未除去酵母菌，這主要是因為研究發現，醋酸菌啟動發酵以及適應基質環境較為緩慢，而酵母菌與醋酸菌具有互利共生的關系，當與酵母菌共生發酵時有促進其生長的作用。同時，這也是導致接種醋酸菌發酵（6～27 d）后乙醇含量呈先緩慢降低后急劇下降的原因，發酵結束時乙醇體積分數降低至（0.49±0.09）%。接種乳酸菌（27～41 d）發酵后，乙醇體積分數繼續降低，隨后逐漸穩定于0.47%，無顯著差異（＞0.05）。張巧等探究大果山楂酵素在發酵過程中乙醇含量的變化時發現，在發酵前期，由于酵母菌的發酵作用，產生了大量乙醇，乙醇體積分數持續增加，達到最大值后，在醋酸菌以及發酵后期發生的酯化反應的作用下，使得乙醇含量逐漸降低并趨于穩定，這與本研究結果基本一致。

表2 葡萄酵素發酵過程中乙醇體積分數的變化Table 2 Changes of ethanol content during fermentation of grape Jiaosu

2.3 葡萄酵素發酵過程中總酚含量的變化

葡萄中含有豐富的酚類物質，廣泛分布在葡萄的皮、莖、葉子和核中，其具有抗氧化、抗癌及調節心血管等作用。由圖2可知，葡萄酵素發酵過程中，總酚含量總體呈波動上升趨勢，發酵結束時總酚質量濃度達到最大值466.00 mg/L，顯著高于其他發酵時間樣品（＜0.05），相較于葡萄漿汁，總酚含量提高到2.16 倍，因此發酵過程可顯著提高葡萄酵素的總酚含量。除此之外，已有報道表明其他酵素產品也有此類現象，例如潘梓源等在優化的桂圓酵素發酵工藝下（菌株組合釀酒酵母+醋酸桿菌+植物乳酸桿菌1∶1∶1、接種量10%、發酵溫度30 ℃、時間36 h），制備的桂圓酵素總酚含量是桂圓水提液的5.05 倍。范昊安等在探究蘋果梨酵素發酵過程中總酚含量的變化時，發現發酵結束后總酚含量約增長17.52 倍。剛開始未接種的葡萄漿汁中總酚含量較高，是由于在制備發酵基質時未去除果皮與核。發酵過程中總酚含量的升高，主要有以下兩個方面的原因，其一是發酵基質中高糖以及發酵過程中產生的有機酸等物質產生的高滲透環境使得葡萄基質中的酚類物質溶出；其二是發酵體系中的微生物可使結合酚類、大分子酚類物質轉化成游離、小分子酚類物質，使其含量增加。接種醋酸菌發酵前期（6～13 d）以及接種乳酸菌發酵前期（27～34 d）總酚含量有所下降，這主要是由于在發酵過程中酚類達到一定濃度時對微生物具有抑制作用，因此發酵微生物在生長代謝過程中會產生分解酚類的物質。以上表明，葡萄酵素發酵過程中酚類物質的變化與原料、發酵條件以及微生物的作用等有關。

圖2 葡萄酵素發酵過程中總酚含量的變化Fig. 2 Changes of total phenol content during fermentation of grape Jiaosu

2.4 葡萄酵素發酵過程中SOD以及β-葡萄糖苷酶活力的變化

食用植物酵素在發酵過程中會代謝生成多種功效酶類，例如蛋白酶、-葡萄糖苷酶以及SOD等，其中SOD常被用來衡量食用植物酵素酶活性的高低，而-葡萄糖苷酶則與食用酵素香氣成分的形成以及酚類物質的釋放有關。因此，分析葡萄酵素發酵過程中SOD及-葡萄糖苷酶活力的動態變化具有重要意義。由圖3所示，葡萄酵素發酵過程中SOD活力整體呈波動升高的趨勢，這主要是因為發酵過程中基質環境的改變以及微生物生長代謝分泌相應的功效酶所導致。接種酵母菌（0～6 d）發酵以及接種醋酸菌發酵前中期（6～20 d），SOD活力在22.89～45.00 U/L之間變化且變化不顯著（＞0.05）。隨后接種乳酸菌后，SOD活力繼續升高至最大值135.00 U/L，符合QB/T 5323—2018中SOD活力≥15 U/L的要求，這表明接種發酵有利于葡萄酵素SOD的產生。-葡萄糖苷酶活力變化與總酚含量變化趨勢一致，在接種酵母菌（0～6 d）發酵、接種醋酸菌發酵中后期（13～27 d）以及接種乳酸菌發酵后期（34～41 d）其活力逐漸升高，而接種醋酸菌發酵前期（6～13 d）以及接種乳酸菌發酵前期（27～34 d）其活力下降，發酵結束時酶活力達到最大值266.57 μU/mL，且顯著高于其他發酵時間樣品（＜0.05），這與閻欲曉等研究發現黑曲霉固態發酵甘蔗葉過程中，酚類物質的釋放與-葡萄糖苷酶活力呈顯著正相關一致。這表明葡萄酵素發酵過程中酚類含量的變化與微生物發酵過程中代謝生成的-葡萄糖苷酶活力等有關。

圖3 葡萄酵素發酵過程中SOD及β-葡萄糖苷酶活力的變化Fig. 3 Changes of SOD and β-glucosidase activity during fermentation of grape Jiaosu

2.5 葡萄酵素發酵過程中揮發性風味成分的變化

食用酵素在發酵過程中，不僅能最大程度保留原料本身的香氣成分，而且還可賦予酵素產品新的風味，其揮發性風味成分與原料、發酵方式以及菌種等因素相關。因此，探究葡萄酵素發酵期間揮發性風味物質的變化，對產品精準制備及品質優化具有重要意義。由表3、圖4可知，葡萄酵素發酵過程中產生的揮發性風味成分主要以醇類、酸類和酯類化合物為主，從葡萄漿汁中共檢測出19 種揮發性風味成分，其中酯類6 種、醇類5 種、醛類4 種、醚類2 種、酸類1 種、其他類1 種。發酵結束后葡萄酵素中共檢測出21 種香氣成分，其中有9 種香氣成分與葡萄漿汁相同，新產生的12 種香氣成分主要為乙酸異戊酯、乙酸甲酯等酯類，乙酸、丙酸等酸類以及苯乙醇等醇類物質。

醇類物質主要由發酵過程中微生物代謝氨基酸、糖類等物質產生。由表3、圖4可知，醇類物質主要在接種酵母菌（0～6 d）發酵期間產生，其含量和種類均顯著增加（＜0.05），隨后接種醋酸菌和乳酸菌后，其含量顯著降低（＜0.05），但其種類并未發生明顯變化。醇類物質一方面可賦予葡萄酵素愉悅的風味，如少量高級醇使得葡萄酵素具有淡雅的風味，另一方面還可以與酸類物質發生酯化反應，生成葡萄酵素典型的特征性香氣成分酯類物質。酯類物質具有果香味，其閾值低且氣味活度值較高，故對葡萄酵素的風味貢獻較大，在葡萄酵素發酵后期，長鏈脂肪酸乙酯的生成可以減少葡萄酵素的澀口感，提高其醇厚感。醛類物質在發酵過程中其含量呈先升高后降低的趨勢，且其種類逐漸減少，發酵結束時醛類物質含量減少至0，這與任婷婷等在探究蘋果漿發酵過程中醛類物質的變化相似。醛類物質不穩定，在發酵過程中可被氧化還原為酸或醇類物質。葡萄酵素發酵過程中特征揮發性風味成分主要以醇類、酸類及酯類物質為主，其他香氣成分貢獻較小，因此，在發酵生產葡萄酵素過程中要合理調控工藝參數，使得各類香氣成分達到最佳水平，并且后續還需進一步探究并結合各類非揮發性成分在發酵中的變化規律，從而生產出優質的葡萄酵素產品。

表3 葡萄酵素發酵過程中各類香氣成分質量濃度的變化Table 3 Changes in concentration of each class of aroma components during fermentation of grape Jiaosu μg/mL

圖4 葡萄酵素發酵過程中各類香氣成分的變化Fig. 4 Changes of number of aroma components during fermentation of grape Jiaosu

3 結 論

接種發酵葡萄酵素過程中，不同菌株發酵階段所代謝生成的有機酸不同，在接種酵母菌（0～6 d）發酵過程中主要代謝產生檸檬酸、蘋果酸、酒石酸，接種醋酸菌后（6～27 d）主要生成乙酸，而后乳酸菌發酵階段（27～41 d），主要代謝生成乳酸、檸檬酸；總酸在發酵過程中呈先升高后略微下降的趨勢，乙醇主要于酵母菌（0～6 d）發酵期間產生，隨后逐漸降低并趨于穩定。總酚含量在發酵過程中的變化趨勢與-葡萄糖苷酶活力一致，研究發現其與酚類物質的變化具有正相關性。葡萄酵素發酵過程中SOD活力總體呈波動上升趨勢，發酵結束時達到最大值135.00 U/L，所生成的揮發性風味成分主要以醇類、酸類和酯類物質為主。通過以上研究明確了葡萄酵素接種發酵過程中代謝產物的變化規律，可為葡萄酵素的工業化生產、綜合性開發以及品質的優化提供理論依據和技術參考。