外源脫落酸對發芽玉米籽粒中類胡蘿卜素合成的影響

徐 昊，何偉偉，李大婧，包怡紅,*，羅 浩，王凡予，張鐘元

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于高等植物中的烯萜類化合物，包括胡蘿卜素和葉黃素類。在植物的光合作用中，類胡蘿卜素能夠吸收過量的光能，保護光合作用的細胞器。在人體內，類胡蘿卜素具有很強的抗氧化活性，能保護細胞膜和脂蛋白免受氧破壞，延緩細胞衰老和預防癌癥。但人和動物不能在體內合成類胡蘿卜素，只能從飲食中攝取。

玉米籽粒中營養全面，含有碳水化合物、蛋白質、類胡蘿卜素外，還含有膳食纖維、維生素和微量元素等營養成分。玉米中類胡蘿卜素含量、總酚含量和總花青素含量在種子中較低，但在幼苗中很高。而玉米籽粒在萌發的過程中，類胡蘿卜素、氨基酸、維生素和鈣含量得到了顯著提高，并降低了制品黏度，改善口感形成特殊的風味。因此，玉米籽粒通過萌發處理后可成為功能性食品。已有研究表明，脫落酸（abscisic acid，ABA）處理后可以提高番茄中β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素含量，增強玉米中抗氧化酶活性，然而鮮有關于ABA調控發芽玉米富集類胡蘿卜素的研究。

ABA是一種以異戊二烯為基本結構倍半萜類的植物生長激素，也是類胡蘿卜素代謝途徑中的下游產物。ABA具有抑制生長和促進休眠等作用，除此之外ABA可以有效啟動植物體內抗逆基因表達，有效激活植物體內抗逆免疫系統，增強植物綜合抗性。有研究表明ABA可以通過維持細胞膜穩定性等多個方面增加植物的抗氧化能力。鎢酸鈉（NaWoO）可以抑制內源ABA合成并阻斷其信號傳遞，并抑制幼苗抗氧化能力。

因此，本實驗以不同質量濃度ABA浸泡處理玉米籽粒，研究ABA浸泡處理對發芽玉米籽粒生長、抗氧化及類胡蘿卜素含量的影響，旨在為開發一種快速有效富含類胡蘿卜素的發芽玉米功能食品提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試玉米‘蘇玉29’，2020年產，購于江蘇瑞華農業科技有限公司。

ABA、NaWoO上海阿拉丁有限公司；類胡蘿卜素標準品、2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、Trolox 美國Sigma公司；甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）、甲醇（色譜純）美國Tedia公司；酶聯免疫檢測試劑盒 南京建成生物研究所；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptMaster Mix試劑盒 北京寶日醫生物技術有限公司；Powerup SYBR Green Master Mix試劑盒 美國Thermo Fisher公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BS224S電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器公司；LBI-150生化培養箱 上海龍躍儀器設備有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；Q3熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Thermo Fisher公司；A11分析研磨機德國IKA公司；5424R臺式高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 發芽玉米籽粒的培養

玉米籽粒用蒸餾水清洗去除雜質，置于0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡25 min消毒處理，用蒸餾水清洗數次至pH值為中性。室溫25 ℃用ABA溶液（2.5、5、7.5 mg/L和10 mg/L）和8 g/L NaWoO溶液對玉米進行24 h浸泡處理。將浸泡好的玉米用蒸餾水清洗后轉入墊有雙層濾紙的培養皿中，以蒸餾水作為培養液，在25 ℃避光條件下恒溫培養。發芽過程中每6 h噴灑一次蒸餾水，以保持玉米表面濕潤，發芽72 h后，收獲發芽玉米，立即用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 理化指標測定

發芽率根據國際種子試驗協會的公式確定；芽長用游標卡尺測定。

可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定；游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定。內源激素ABA含量采用酶聯免疫檢測試劑盒測定。

1.3.3 VC和總酚含量的測定

VC測定：稱取2.5 g玉米粉末，加入少量4 ℃預冷的0.25%偏磷酸溶液浸提，冰浴條件下研磨后，用0.25%偏磷酸溶液定容至25 mL，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液經0.45 μm水系膜過濾后待HPLC測定。

HPLC條件：色譜柱為ZORBAX 300SB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長240 nm；流動相0.03 mol/L正磷酸溶液。

總酚測定：稱取4.0 g玉米粉末，用70%乙醇溶液定容至50 mL。取上述溶液1.0 mL，加入5 mL蒸餾水、1.0 mL福林試劑和3.0 mL 7.5% NaCO溶液。在765 nm波長處測定吸光度。總酚含量以沒食子酸毫克當量（mg/g）表示。

1.3.4 類胡蘿卜素的提取與測定

將收集冷藏保存的新鮮玉米籽粒真空冷凍干燥后，粉碎過40 目篩得到玉米粉。稱取3.0 g玉米粉置于磨口錐形瓶中，加入30 mL正己烷-乙醇-丙酮-甲苯（10∶6∶7∶7，V/V）混合萃取液，靜置3～4 h，加入2 mL 40% KOH-甲醇溶液，搖勻后置于暗處25 ℃皂化16 h，將皂化液轉入分液漏斗，加入30 mL正己烷，振蕩搖勻，再加入38 mL 10%硫酸鈉溶液，收集上層溶液，旋轉蒸發，氮氣吹干，用2 mL甲醇溶解，過0.45 μm有機濾膜后，待HPLC分析。

HPLC條件：色譜柱為YMC-C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL；檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長450 nm；流動相：A為水-MTBE-甲醇（5∶25∶75，V/V）；B為水-MTBE-甲醇（5∶85∶10，V/V）。梯度洗脫：0～4.5 min，95%～80% A、5%～20% B；4.5～12.5 min，80%～50% A、20%～50% B；12.5～18 min，50%～25% A、50%～75% B；18～24 min，25%～5% A、75%～95% B；24～30 min，5% A、95% B。

1.3.5 基因表達量分析

按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書操作步驟提取發芽玉米總RNA，按照PrimeScriptMaster Mix試劑盒合成cDNA。根據NCBI上公布的各個基因序列設計引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按Powerup SYBR Green Master Mix試劑盒配制real-time PCR體系。以玉米中的肌動蛋白基因（ACTIN）作為內參基因，用2法計算各個基因的相對表達量。

表1 real-time PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR analysis

1.3.6 抗氧化酶活性的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性通過其抑制50%硝基藍四唑的光還原能力確定。在25 ℃下反應30 min后，在560 nm波長處測定吸光度。對照組同時進行，不提取酶。比活力以每毫克蛋白質的活性單位表示。蛋白含量參照Lowry法蛋白濃度測定試劑盒測定。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創木酚氧化法測定。在470 nm波長下每隔1 min記錄一次吸光度的變化。以每分鐘吸光度變化0.01表示1 個過氧化物酶活性單位（U），最終酶活性以U/mg表示。

1.3.7 抗氧化能力的測定

采用Müller等的方法評價其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、ABTS陽離子自由基的活性，分別在517 nm和405 nm波長處測定反應溶液的吸光度。結果以Trolox當量（mg/g和mmol/g）表示。鐵離子抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）在593 nm波長處測定吸光度，用硫酸亞鐵當量表示。

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 ABA處理對發芽玉米芽長和發芽率的影響

圖1 ABA處理對發芽玉米發芽率和芽長的影響Fig. 1 Effect of ABA treatment on the germination rate and sprout length of germinated maize

如圖1所示，玉米籽粒的發芽率和芽長隨著ABA質量濃度的增加呈現降低趨勢，當ABA質量濃度為2.5 mg/L時，發芽率和芽長分別較對照組降低3.9%和4.8%。ABA質量濃度增加則會抑制玉米籽粒的生長。而NaWoO處理后發芽率和芽長分別較對照組降低2.3%和3.8%。ABA有“休眠素”之稱，會促進種子休眠和抑制幼苗生長。Wang Zhiying等在研究中發現ABA會抑制甘藍芽的長度。這可能是因為添加外源ABA后玉米籽粒中ABA激素含量增高，而種子內ABA含量增加可能會導致種子生長趨勢緩慢。

2.2 ABA處理對發芽玉米可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和內源ABA含量的影響

圖2 ABA處理對發芽玉米可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和內源ABA含量的影響Fig. 2 Effect of ABA treatment on the contents of soluble protein, free amino acids, proline and endogenous ABA in germinated maize

如圖2所示，隨ABA質量濃度增加，發芽玉米籽粒中可溶性蛋白、游離氨基酸和脯氨酸的含量呈逐漸增加的趨勢，而NaWoO處理均低于對照組。在10 mg/L ABA處理組中，玉米籽粒中可溶性蛋白、游離氨基酸和脯氨酸含量分別較對照組提高9.9%、45.3%和47.0%。內源ABA含量隨外源ABA添加呈大幅度升高的趨勢。在7.5 mg/L ABA處理下內源ABA含量達到最高為47.16 ng/g，較對照組提高74.5%，當ABA質量濃度為10 mg/L時，內源ABA含量較7.5 mg/L ABA處理組略有下降（P＞0.05），但NaWoO較對照組下降43.6%。這說明外源ABA可以正調節內源ABA含量。脯氨酸是重要的滲透調節物質，可以起到膜穩定劑的作用。可溶性蛋白可提高細胞的保水能力，從而保證細胞膜的穩定性。王相敏等研究發現外源ABA可以提高玉米幼苗中可溶性蛋白和脯氨酸的含量。可溶性蛋白、游離氨基酸和脯氨酸含量的增加可以改善玉米籽粒的生理狀態，維持幼苗的正常生長。

2.3 ABA處理對發芽玉米VC和總酚含量的影響

圖3 ABA處理對發芽玉米中VC和總酚含量的影響Fig. 3 Effect of ABA treatment on the contents of vitamin C and total phenols in germinated maize

如圖3所示，隨著ABA質量濃度的增加發芽玉米籽粒中VC和總酚的含量呈先增加后降低趨勢。總酚含量在5 mg/L ABA處理下達到3.83 mg/g，較對照組提高51.4%，張一冉等發現ABA可以促進李果實中總酚含量的富集，其原因可能是ABA延緩果實多酚氧化酶的上升，并避免了多酚氧化酶和總酚的接觸。VC含量在7.5 mg/L ABA處理下達到最高，較對照組提高46.2%，可能是因為外源ABA處理通過影響AsA合成相關基因的表達從而促進VC含量的增加。而NaWoO處理后發芽玉米籽粒中總酚和VC含量較對照組有所降低，其原因可能是NaWoO間接抑制了ABA的合成，從而導致發芽玉米籽粒中VC和總酚含量有所降低。

2.4 ABA處理對發芽玉米富集類胡蘿卜素含量的影響

表2 不同質量濃度ABA處理下發芽玉米中類胡蘿卜素含量Table 2 Carotenoid contents in germinated maize treated with different concentrations of ABA μg/g

本研究在發芽玉米籽粒中檢測到6 種類胡蘿卜素，包括葉黃素、玉米黃質、α-隱黃質、β-隱黃質、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。如表2所示，玉米籽粒中主要的類胡蘿卜素為葉黃素和玉米黃質，其他物質含量相對較低。經過ABA處理后，發芽玉米籽粒6 種類胡蘿卜素含量隨ABA質量濃度增加呈現先升高而后降低的趨勢。經過5 mg/L ABA處理后，6 種類胡蘿卜素含量均達到最大值，葉黃素、玉米黃質、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和β-隱黃質含量較對照組分別提高27.6%、20.1%、52.4%、71.7%和12.5%。而NaWoO處理后，葉黃素、玉米黃質、α-隱黃質和α-胡蘿卜素分別較對照組下降了10.6%、7.2%、6.6%和19%，β-隱黃質和β-胡蘿卜素較對照組差異不明顯。Barickman等發現外源ABA可以提高番茄中類胡蘿卜素含量，有效地保護葉黃素循環，并推測ABA可能通過增加PSY等關鍵酶的活性間接調控類胡蘿卜素途徑。

2.5 ABA處理對類胡蘿卜素合成酶基因表達量的影響

利用real-time PCR檢測ABA處理后類胡蘿卜素代謝相關基因表達的變化。如圖4所示，隨ABA質量濃度的增加，基因表達呈先上升后下降的趨勢。在5 mg/L ABA處理下，PSY、PDS、ZDS、LCYB、LCYE、BCH1和CYP97C的轉錄表達量最高，分別是對照組的1.95、2.02、1.70、1.65、1.96、1.71 倍和2.37 倍；NCED的轉錄表達在7.5 mg/L ABA處理下達到最高為1.65 倍。而NaWoO處理后關鍵酶基因表達量下調，其中NCED基因表達量下降最多。

圖4 ABA處理對類胡蘿卜素關鍵合成酶基因表達量的影響Fig. 4 Effect of ABA treatment on the expression of key genes associated with carotenoid synthase

在類胡蘿卜素途徑中，PSY主要決定反應速率和控制代謝通量。在擬南芥幼苗中，ABA可以正調控PSY基因表達從而導致類胡蘿卜素含量增加。Wu Qiong等發現ABA可以誘導番茄果實中PDS和ZDS基因表達上調，使類胡蘿卜素含量增加。而內源ABA可以通過調節基因表達刺激類胡蘿卜素的合成。本實驗發現ABA可以誘導PSY、PDS和ZDS基因表達量上調，這可能是促進類胡蘿卜素合成的原因。LCYB和LCYE可以催化番茄紅素產生α-胡蘿卜素或β-胡蘿卜素，BCH1可將β-胡蘿卜素轉化為β-隱黃質，BCH1和CYP97C可將α-胡蘿卜素轉化為葉黃素。因此，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和葉黃素含量的增加，可能與LCYB和LCYE基因表達上調有關；而β-隱黃質和葉黃素含量增加，可能是BCH1和CYP97C基因的上調原因。高等植物中ABA生物合成的關鍵酶是NCED。NCED基因過量表達可以促進ABA的合成。而NaWoO處理抑制類胡蘿卜素含量的富集，可能是NaWoO抑制了內源ABA的合成。

2.6 ABA處理對抗氧化酶活性的影響

ABA處理后顯著提高了發芽玉米籽粒中抗氧化酶活性（圖5）。5 mg/L ABA處理后SOD（48.36 U/mg）和POD（24.55 U/mg）較對照組分別提高40.0%和38.6%。抗氧化酶系統中的SOD、POD等抗氧化酶協同清除植物體內過量的活性氧，維持生理生化平衡。王相敏等發現添加外源ABA可以提高玉米在干旱環境中SOD和POD活性。這可能是因為ABA可以幫助清除植物體內的氧自由基，保護細胞盡量不受傷害，增強植物幼苗的抗氧化酶活性。而NaWoO抑制內源ABA的合成，可能是NaWoO處理后抗氧化酶活性降低的原因。

圖5 不同質量濃度ABA處理對發芽玉米中抗氧化酶活性的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of ABA treatment on the antioxidant enzyme activity in germinated maize

2.7 ABA處理對抗氧化能力的影響

圖6 不同質量濃度ABA處理對發芽玉米中抗氧化能力的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of ABA treatment on the antioxidant capacity of germinated maize

如圖6所示，隨著ABA質量濃度的升高，發芽玉米籽粒中總抗氧化能力呈先升高而后降低的趨勢。5 mg/L ABA處理后DPPH自由基清除能力（27.42 mg/g）、ABTS陽離子自由基清除能力（1.66 mmol/g）和FRAP（0.48 mmol/g）較對照組分別提高21.2%、12.2%和45.5%。DPPH和ABTS是基于單電子轉移反應機制的抗氧化評價方法，能夠反映體外清除自由基的能力。FRAP是通過氧化還原能力反映物質總抗氧化的活性。徐穎等在研究蘋果時發現，總酚與抗氧化之間存在顯著正相關性。本實驗結果與之相符合。

2.8 ABA處理下類胡蘿卜素含量與總酚、VC、抗氧化酶活性和抗氧化能力的相關性分析

圖7 ABA處理下類胡蘿卜素含量與總酚、VC、抗氧化酶活性和抗氧化能力的相關性分析Table 7 Correlation analysis between carotenoid content and total phenols, VC, antioxidant enzyme activity and antioxidant capacity in germinated maize with ABA treatment

如圖7所示，發芽玉米中抗氧化酶活性和抗氧化能力與總酚含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與VC含量相關性較弱。Maisuthisakul等認為植物體內的抗氧化活性主要由酚類物質提供，酚類物質與抗氧化活性直接相關。同時葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素與抗氧化酶活性、抗氧化能力和總酚呈極顯著正相關（P＜0.01），玉米黃質和β-隱黃質與抗氧化酶活性、抗氧化能力和總酚呈顯著正相關（P＜0.05）。綜上，玉米籽粒中抗氧化能力和抗氧化酶活性的增強可能與總酚、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量增加有關。

3 結 論

探究ABA對發芽玉米籽粒生長和類胡蘿卜素含量的影響。結果表明，ABA會抑制發芽玉米籽粒的發芽率和芽長。隨著ABA質量濃度升高，發芽玉米籽粒中可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和內源激素ABA含量逐漸增加。ABA可以有效提高VC和總酚含量，但當ABA質量濃度過高時，則會出現降低的現象。5 mg/L ABA是發芽玉米籽粒富集類胡蘿卜素的最佳條件，這可能與ABA可以正調節合成類胡蘿卜素相關基因有關。而NaWoO抑制類胡蘿卜素含量的累積，這可能與NaWoO間接抑制內源激素ABA合成有關。5 mg/L ABA處理后，SOD、POD抗氧化酶活性和DPPH、ABTS、FRAP抗氧化能力達到最大值，并發現總酚、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量與抗氧化能力和抗氧化酶活性呈顯著相關性。因此，5 mg/L ABA處理發芽玉米籽粒可作為提高發芽玉米類胡蘿卜素含量的一種方法，并為開發功能性發芽玉米提供理論參考。