HPLC法測定維藥硬尖神香草中蘆丁含量

王 瑩，姜君君，蘭 衛，武嘉林

(1.新疆醫科大學附屬中醫醫院，新疆 烏魯木齊 830002；2.烏魯木齊市第四人民醫院，新疆 烏魯木齊 830002;3.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊 830017；4.新疆華世丹藥業股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011)

硬尖神香草是維吾爾醫常用藥材，維吾爾名為“祖帕”，為唇形科植物硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)的干燥全草[1]，硬尖神香草和以硬尖神香草為主藥的寒喘祖帕顆粒均收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準：維吾爾藥分冊》(WS3-BW-0195-98)[2]。研究表明，神香草具有祛痰、止咳、平喘、抗炎、鎮痛等藥理作用[3-5]。

作者采用高效液相色譜(HPLC)法測定硬尖神香草中蘆丁含量，旨在為制定硬尖神香草質量控制標準提供依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

硬尖神香草，采集于新疆和田地區策勒縣博斯坦鄉神香草人工種植基地，經新疆醫科大學中藥資源教研室盛萍教授鑒定為硬尖神香草(HyssopuscuspidatusBoriss.)的干燥全草。

蘆丁標準品(批號20130329)，上海源葉生物科技有限公司；乙腈(批號67-56-1)、甲醇(批號61-56-1)，色譜純，南京化學試劑股份有限公司；磷酸(批號20150209)、乙酸(批號20160319)，天津致遠化學試劑有限公司。

Agilent 1200-DAD型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；KQ-200KD型數控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；CBM-20A型高效液相色譜儀(LC-6AD雙泵，SPD-20A紫外雙波長檢測器，SIL-20A自動進樣器，CTO-10AS柱溫箱，LC-solution色譜工作站)，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

精密稱取4.12 mg蘆丁標準品，用甲醇定容于100 mL容量瓶中，即得0.041 2 mg·mL-1蘆丁標準溶液。

1.2.2 供試溶液的配制

稱取硬尖神香草藥材1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入10 mL甲醇，稱重；用100 Hz超聲波提取40 min，取出，放至常溫，再用甲醇補足缺失的質量，搖勻；用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.2.3 色譜條件

Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫程序：0～9 min，13%～16%B；9～20 min,16%～32%B；20～40 min,32%～60%B；40～45 min,60%～13%B，流速1.0 mL·min-1，檢測波長354 nm，進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 HPLC圖譜

蘆丁標準溶液和供試溶液的HPLC圖譜見圖1。

圖1 蘆丁標準溶液(a)和供試溶液(b)的HPLC圖譜

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系

精密吸取蘆丁標準溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，按1.2.3色譜條件進樣測定。以峰面積(y)為縱坐標、蘆丁濃度(x)為橫坐標繪制標準曲線(圖2)，擬合得線性回歸方程為：y=2055.8x+0.85,R2=0.9993。表明，蘆丁濃度在0.004 12～0.020 60 mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

圖2 蘆丁的標準曲線

2.2.2 精密度

精密吸取蘆丁標準溶液適量，按1.2.3色譜條件連續進樣測定6次。測得峰面積分別為90.5、91.2、89.6、90.1、88.3、92.1，平均峰面積為90.3，RSD值為1.45%。表明儀器的精密度良好。

2.2.3 重復性

平行稱取6份硬尖神香草藥材各1.0 g，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進樣測定。測得峰面積分別為29.5、30.2、29.4、30.7、30.7、29.7，平均峰面積為30.0，RSD值為1.95%。表明該方法的重復性良好。

2.2.4 穩定性

取供試溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h按1.2.3色譜條件進樣測定。測得峰面積分別為30.3、31.0、30.3、29.8、29.3、30.6，平均峰面積為30.2，RSD值為1.98%。表明供試溶液在10 h內穩定性良好。

2.2.5 加標回收率

平行稱取9份硬尖神香草藥材各1.0 g，均分為3組，分別加入1.78 mL(低濃度組)、3.54 mL(中濃度組)、3.72 mL(高濃度組)蘆丁標準溶液，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進樣測定，結果見表1。

表1 加標回收率結果

由表1可知，低濃度組的平均加標回收率為100.91%，RSD值為2.07%；中濃度組的平均加標回收率為101.60%，RSD值為1.03%；高濃度組的平均加標回收率為100.96%，RSD值為1.96%。

2.3 硬尖神香草中蘆丁含量的測定

取硬尖神香草藥材3份，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進樣測定。測得峰面積分別為30.8、31.2、30.5，平均峰面積為30.83，計算得到硬尖神香草中蘆丁含量為0.146 mg·g-1。

2.4 討論

蘆丁為黃酮類成分，具有抗氧化、抗炎癥、抗病原微生物、提高免疫力等作用[6]。董元火等[7]采用HPLC法測定野生蘄艾中蘆丁含量，流動相為甲醇-0.4%磷酸(55∶45，體積比，下同)，檢測波長257 nm；作者發現該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁所對應位置未出峰。肖作奇等[8]采用HPLC法測定地膚子中蘆丁含量，流動相為乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫；作者發現該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁出峰時間與蘆丁標準品一致，但峰面積較小。齊紅等[9]采用HPLC法測定白花蛇舌草中蘆丁含量，流動相為甲醇-0.1%磷酸(30∶70)，流速1.0 mL·min-1，檢測波長353 nm；作者發現該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁出峰效果不理想。于姍姍等[10]采用HPLC法測定槐枝中蘆丁含量，流動相為甲醇-1%冰醋酸(32∶68)，流速1.0 mL·min-1，柱溫36 ℃，檢測波長257 nm；作者發現該色譜條件下硬尖神香草中蘆丁分離度不理想。作者以乙腈-0.2%磷酸為流動相，調整流動相比例，梯度洗脫，發現硬尖神香草中蘆丁出峰時間與蘆丁標準品一致，峰形較好，分離度>1.5，理論塔板數>3000。因此，選用乙腈-0.2%磷酸為流動相測定硬尖神香草中蘆丁含量。

維藥硬尖神香草的品種選擇很重要，從直觀判斷，正宗硬尖神香草花朵正常開放是藍紫色的，而其它品種神香草是除藍紫色以外的其它顏色。

由于硬尖神香草與大苞荊芥外形、用法相似，故維吾爾族民間用藥常以大苞荊芥充當硬尖神香草，造成藥材誤用，導致療效下降。因此，制定硬尖神香草質量控制標準，為臨床應用提供依據十分重要。

3 結論

首次建立了測定硬尖神香草中蘆丁含量的HPLC法。色譜條件為：Hypersil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，柱溫30 ℃，流動相為乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測波長354 nm，進樣量10 μL。結果表明，蘆丁濃度在0.004 12～0.020 60 mg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系；硬尖神香草中蘆丁含量為0.146 mg·g-1。采用HPLC法測定硬尖神香草中蘆丁含量準確可靠，為制定硬尖神香草質量控制標準提供了依據。