響應(yīng)面法優(yōu)化耙耙柑皮果膠超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性研究

葉群麗，馮 可，梁大偉，何靖柳，章 斌

(雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)院，四川 雅安 625000)

果膠是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然多糖，可作為增稠劑、膠凝劑和乳化劑等添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)；果膠也是水溶性膳食纖維，對腹瀉、糖尿病和肥胖等病癥有較好的療效；果膠還具有抗輻射、抗氧化、抗癌及抗菌等功能[1-3]。目前，果膠的提取方法主要有酸法、鹽析法、離子交換樹脂法、酶法、微波輔助法及超聲輔助法等[4-7]。耙耙柑皮為食品工業(yè)廢棄物，從中提取果膠，既豐富了果膠的原料，又提升了耙耙柑皮的附加值。鑒于此，作者以四川省蒲江縣特產(chǎn)耙耙柑皮為原料，采用超聲協(xié)同水浴振蕩輔助酸法提取耙耙柑皮果膠，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并研究耙耙柑皮果膠的抗氧化活性，為耙耙柑皮資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮耙耙柑，購于雅安市水果市場。耙耙柑皮切塊，煮沸，漂洗，干燥，粉碎，密封，備用[6]。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)、Tris-HCl緩沖液、無水乙醇、鹽酸、抗壞血酸(VC)、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫(H2O2)、焦性沒食子酸等均為分析純。

SMF-2002型磨粉機(jī)，浙江蘇泊爾股份有限公司；DHG-9240AT型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海丙林電子科技有限公司；AUW-120D型電子天平，島津菲律賓工廠；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；PHS-3C型雷磁酸度計，上海精科儀器廠；SHA-B型數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；KDC-1044型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-1800PC-DS2型紫外可見分光光度計，上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.2 耙耙柑皮果膠的提取

稱取耙耙柑皮粉末1.000 0 g，加入蒸餾水溶解，混勻，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值，超聲后水浴振蕩，離心；再進(jìn)行二次提取，合并濾液，旋蒸濃縮，醇沉析出果膠，真空干燥。按式(1)計算果膠提取率[6]：

(1)

1.3 提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以超聲時間20 min、超聲溫度60 ℃、液料比40∶1(mL∶g，下同)、pH值 2.0、振蕩時間20 min、振蕩溫度90 ℃為基礎(chǔ)條件，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察超聲時間(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)、超聲溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、液料比(30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1)、pH值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)、振蕩時間(10 min、15 min、20 min、25 min、30 min)、振蕩溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)[6]對耙耙柑皮果膠提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原則，選擇對果膠提取率影響較大的pH值(A)、液料比(B)、超聲溫度(C)為變量，以果膠提取率為響應(yīng)值，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

1.4 耙耙柑皮果膠的抗氧化活性評價

1.4.1 對DPPH自由基清除能力的測定

將耙耙柑皮果膠配制成一系列不同濃度的樣品溶液。分別取樣品溶液2.0 mL于棕色具塞試管中，加入0.2 mmol·L-1DPPH自由基乙醇溶液2.0 mL，搖勻后，于暗室放置1 h，測定517 nm處吸光度(A樣品)[8-10]；以2.0 mL樣品溶液與2.0 mL無水乙醇的混合溶液為對照(A對照)，以DPPH自由基乙醇溶液為空白(A空白)[8-10]。以VC為陽性對照。按式(2)計算耙耙柑皮果膠對DPPH自由基的清除率[8-10]：

(2)

(3)

1.4.3 對·OH清除能力的測定

將耙耙柑皮果膠配制成一系列不同濃度的樣品溶液。分別取樣品溶液2.0 mL于棕色具塞試管中，加入2.0 mmol·L-1FeSO4溶液2.0 mL、2.0 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液2.0 mL、0.03%H2O2溶液0.1 mL，振蕩搖勻，于37 ℃下避光保溫35 min，測定510 nm處吸光度(A樣品)；以蒸餾水代替樣品溶液為對照(A對照)[8-10]。以VC為陽性對照。按式(4)計算耙耙柑皮果膠對·OH的清除率：

(4)

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時間對耙耙柑皮果膠提取率的影響(圖1)

圖1 超聲時間對耙耙柑皮果膠提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲時間的延長，耙耙柑皮果膠提取率先升高后緩慢降低，當(dāng)超聲時間為20 min時，果膠提取率達(dá)到最高。故，提取耙耙柑皮果膠適宜的超聲時間為20 min。

2.1.2 超聲溫度對耙耙柑皮果膠提取率的影響(圖2)

由圖2可知，隨著超聲溫度的升高，耙耙柑皮果膠提取率先升高后降低，當(dāng)超聲溫度為60 ℃時，果膠提取率達(dá)到最高。故，提取耙耙柑皮果膠適宜的超聲溫度為60 ℃。

圖2 超聲溫度對耙耙柑皮果膠提取率的影響

2.1.3 液料比對耙耙柑皮果膠提取率的影響(圖3)

由圖3可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，耙耙柑皮果膠提取率先升高后迅速降低，當(dāng)液料比為40∶1時，果膠提取率達(dá)到最高。故，提取耙耙柑皮果膠適宜的液料比為40∶1。

圖3 液料比對耙耙柑皮果膠提取率的影響

2.1.4 pH值對耙耙柑皮果膠提取率的影響(圖4)

圖4 pH值對耙耙柑皮果膠提取率的影響

由圖4可知，隨著提取液pH值的增大，耙耙柑皮果膠提取率先升高后迅速降低，當(dāng)提取液pH值為2.0時，果膠提取率達(dá)到最高。故，提取耙耙柑皮果膠適宜的pH值為2.0。

2.1.5 振蕩時間對耙耙柑皮果膠提取率的影響(圖5)

由圖5可知，隨著振蕩時間的延長，耙耙柑皮果膠提取率先升高后緩慢降低，當(dāng)振蕩時間為20 min時，果膠提取率達(dá)到最高。故，提取耙耙柑皮果膠適宜的振蕩時間為20 min。

圖5 振蕩時間對耙耙柑皮果膠提取率的影響

2.1.6 振蕩溫度對耙耙柑皮果膠提取率的影響(圖6)

圖6 振蕩溫度對耙耙柑皮果膠提取率的影響

由圖6可知，隨著振蕩溫度的升高，耙耙柑皮果膠提取率逐漸升高，當(dāng)振蕩溫度為90 ℃時，果膠提取率達(dá)到最高。故，提取耙耙柑皮果膠適宜的振蕩溫度為90 ℃。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析[11-12]

采用Design-Expert 10.0.8軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立模型方程為：Y=28.38-1.96A-0.6362B-0.175C-0.7375AB-0.24AC+0.3BC-4.54A2-1.89B2-1.13C2。

回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析

3D響應(yīng)面圖及等高線圖可以直觀地反映pH值、液料比、超聲溫度兩兩交互作用與響應(yīng)值果膠提取率的關(guān)系。各因素交互作用對耙耙柑皮果膠提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖7所示。

響應(yīng)曲面越陡峭表示交互作用越大，反之則交互作用越小。由圖7可知，響應(yīng)曲面陡峭程度為AB>AC>BC，說明AB的交互作用較AC和BC更顯著，即pH值與液料比的交互作用對果膠提取率的影響較大[11-12]。上述分析與表3的方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素交互作用對耙耙柑皮果膠提取率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.3 最佳工藝的確定及驗(yàn)證

采用Design-Expert 軟件優(yōu)化功能，通過模型預(yù)測耙耙柑皮果膠的最佳提取工藝條件為：pH值1.90、液料比39.33∶1、超聲溫度59.27 ℃，果膠提取率的理論值為28.63%。考慮到實(shí)際操作，修正最佳提取工藝條件為：pH值 2.0、液料比40∶1、超聲溫度60 ℃，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，果膠平均提取率為28.42%。

2.4 耙耙柑皮果膠的抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除率(圖8)

圖8 耙耙柑皮果膠對DPPH自由基的清除率

由圖8可知，耙耙柑皮果膠和VC對DPPH自由基均有清除作用。VC在較低濃度0.2 mg·mL-1時，對DPPH自由基的清除率達(dá)95.5%，隨著濃度的增大，VC對DPPH自由基的清除率始終保持在95%左右，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化能力；耙耙柑皮果膠對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增大緩慢升高，當(dāng)濃度為2.0 mg·mL-1時，清除率達(dá)到43.9%。表明，耙耙柑皮果膠具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化能力顯著低于VC。

圖9 耙耙柑皮果膠對的清除率 scavenging rate of pectin from Papagan peels

2.4.3 對·OH的清除率(圖10)

圖10 耙耙柑皮果膠對·OH的清除率

由圖10可知，耙耙柑皮果膠和VC對·OH均有清除作用。VC濃度為0.8 mg·mL-1時，對·OH的清除率為70.0%，之后繼續(xù)增大濃度，清除率變化不大；耙耙柑皮果膠對·OH的清除率隨著濃度的增大緩慢升高，當(dāng)濃度為2.0 mg·mL-1時，對·OH的清除率達(dá)到35.0%。表明，耙耙柑皮果膠具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化能力顯著低于VC。

3 結(jié)論