響應(yīng)面法優(yōu)化綿馬貫眾多酚超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性研究

侯敏娜，侯少平，何 璐，張 嬋，陳佳瑤

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

綿馬貫眾(Dryopteriscrassirhizoma)為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨的干燥根莖和葉柄殘基,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,具有清熱解毒、涼血止血、殺蟲的功效[1-3]，可用于流行性感冒、癍疹、痢疾、咳血、蟲積腹痛等疾病的治療[4-11]。綿馬貫眾含有多酚類、黃酮類、萜類、甾類、苯丙素類、脂肪族類等[11-15]活性成分。其中多酚類化合物可淬滅單線態(tài)氧，清除體內(nèi)自由基，還能絡(luò)合催化氧自由基產(chǎn)生的金屬離子，阻斷自由基的產(chǎn)生[16]，具有較強(qiáng)的抗氧化活性。與正交設(shè)計(jì)法、均勻設(shè)計(jì)法相比，響應(yīng)面法具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、直觀、高效、方便及在短時(shí)間全面預(yù)測實(shí)驗(yàn)參數(shù)等特點(diǎn)[17]。鑒于此，作者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化綿馬貫眾多酚的超聲輔助提取工藝[18]，并通過測定綿馬貫眾多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以期為綿馬貫眾資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

綿馬貫眾，購于陜西西安萬壽路藥材市場，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院中藥學(xué)教研室雷國蓮教授鑒定為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨的干燥根莖和葉柄殘基。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110831-201906)，中國食品藥品檢定研究院；抗壞血酸(VC)，上海源葉生物科技有限公司；DPPH(批號(hào)S18M11M109858)、ABTS(批號(hào)C10947528)，上海麥克林生物科技有限公司；福林酚，上海荔達(dá)生物科技有限公司；乙醇，成都科隆化學(xué)有限公司；無水碳酸鈉，天津天力化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CP225D型電子分析天平，賽多利斯；KQ5200DE型數(shù)控超聲波提取儀，昆山超聲儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司；HG-9075L型立式鼓風(fēng)干燥箱，北京亞太科隆技術(shù)有限公司。

1.2 綿馬貫眾多酚的提取

將干燥的綿馬貫眾藥材粉碎，過40目篩，于密封塑料袋中保存。準(zhǔn)確稱取1.000 g綿馬貫眾粉末，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，室溫下浸泡1 h后，超聲處理一定時(shí)間，過濾，收集濾液，即為綿馬貫眾多酚提取液。

1.3 綿馬貫眾多酚得率的測定

1.3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[17-18]

精密稱取干燥的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，配制成濃度為1 mg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL于10 mL試管中，加入10%福林酚試劑 1 mL，搖勻；再加入15%碳酸鈉溶液 2 mL，定容至10 mL，混勻，室溫反應(yīng)1 h后，測定765 nm處吸光度，重復(fù)測定3次，取平均值。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合得線性回歸方程為：y=0.828x+0.0744，R2=0.9994。表明，沒食子酸濃度在0.02～0.10 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 綿馬貫眾多酚得率的計(jì)算

吸取1 mL綿馬貫眾多酚提取液于5 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度；準(zhǔn)確移取0.1 mL提取液稀釋液，按1.3.1方法測定765 nm處吸光度，按式(1)計(jì)算綿馬貫眾多酚得率(Y)：

(1)

式中：c為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多酚濃度，mg·mL-1；V為綿馬貫眾多酚提取液稀釋液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為綿馬貫眾粉末質(zhì)量，g。

1.4 提取工藝優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)，考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%)、超聲溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、超聲時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)對(duì)綿馬貫眾多酚得率的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以綿馬貫眾多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間為自變量，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化綿馬貫眾多酚的超聲輔助提取工藝。

1.5 抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.5.1 對(duì)DPPH自由基清除能力的測定

精密稱取2 mg DPPH粉末于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，得DPPH自由基溶液。分別配制濃度(mg·mL-1)為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0的綿馬貫眾多酚溶液和VC溶液各100 mL。準(zhǔn)確移取各濃度樣品溶液2 mL于10 mL比色管中，加入2 mL DPPH自由基溶液，混勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處吸光度，每個(gè)濃度平行測定3次，取平均值。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(2)

式中：A0為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL 無水乙醇的吸光度；A1為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL樣品溶液的吸光度；A2為2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液的吸光度。

1.5.2 對(duì)ABTS自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[19-20]測定734 nm處吸光度，按式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率：

(3)

式中：A0為2 mL ABTS自由基溶液+2 mL無水乙醇的吸光度；A1為2 mL ABTS自由基溶液+2 mL樣品溶液的吸光度；A2為2 mL無水乙醇+2 mL樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比的選擇(圖2)

注：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間40 min

由圖2可知，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，綿馬貫眾多酚得率先升高后降低，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，多酚得率達(dá)到最高。可能是由于，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，大部分多酚從綿馬貫眾中溶出，已達(dá)飽和狀態(tài)，再增加提取溶劑用量，反而會(huì)引入更多雜質(zhì)，使后續(xù)濃縮、分離等工序難度加大。因此，選擇1∶30作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)料液比的中心點(diǎn)。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇(圖3)

注：料液比1∶30、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間40 min

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，綿馬貫眾多酚得率先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，多酚得率達(dá)到最高。可能是由于，綿馬貫眾多酚極性與50%乙醇極性較接近，在其中溶解度較高。因此，選擇50%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)的中心點(diǎn)。

2.1.3 超聲溫度的選擇(圖4)

注：料液比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲時(shí)間40 min

由圖4可知，隨著超聲溫度的升高，綿馬貫眾多酚得率先升高后降低，當(dāng)超聲溫度為60 ℃時(shí)，多酚得率達(dá)到最高。可能是由于，隨著超聲溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，溶出的多酚增加；但多酚的酚羥基化學(xué)性質(zhì)較活潑，熱穩(wěn)定性較差，當(dāng)超聲溫度過高時(shí)，多酚結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多酚得率降低。因此，選擇60 ℃作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)超聲溫度的中心點(diǎn)。

2.1.4 超聲時(shí)間的選擇(圖5)

由圖5可知，隨著超聲時(shí)間的延長，綿馬貫眾多酚得率先升高后降低，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，多酚得率達(dá)到最高。可能是由于，超聲時(shí)間過長，會(huì)破壞多酚的結(jié)構(gòu)。因此，選擇40 min作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)超聲時(shí)間的中心點(diǎn)。

注：料液比1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲溫度50 ℃

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(表1)

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到多元回歸方程：Y=9.24-0.096A-0.22B+0.32C-0.11D-0.14AB+0.11AC-0.92AD-0.40BC-0.15BD+0.028CD-0.80A2-0.57B2-0.94C2-0.37D2。

回歸模型的方差分析見表2。

表2 方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)綿馬貫眾多酚得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對(duì)綿馬貫眾多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖6可知，料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)曲面較平緩，兩者等高線近似圓形(圖6a)，說明兩者相互作用對(duì)綿馬貫眾多酚得率的影響較弱，其中乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)曲面較陡，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響較為明顯；料液比與超聲溫度的等高線近似橢圓形(圖6b)，說明兩者交互作用對(duì)多酚得率的影響較大，其中超聲溫度的響應(yīng)曲面較料液比的陡，說明超聲溫度的影響更為顯著；料液比與超聲時(shí)間的等高線為橢圓形，兩者的響應(yīng)曲面均極陡(圖6c)，說明兩者交互作用對(duì)多酚得率的影響較大，這與方差分析中AD呈高度顯著性的結(jié)果一致；乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的響應(yīng)曲面較平緩，兩者等高線近似圓形(圖6d)，說明兩者交互作用對(duì)多酚得率的影響不明顯；超聲溫度的響應(yīng)曲面較超聲時(shí)間的陡(圖6e)，說明超聲溫度對(duì)多酚得率的影響較大，這與方差分析中C2的影響高度顯著相吻合；乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度的等高線為橢圓形(圖6f)，說明兩者交互作用對(duì)多酚得率的影響顯著，這與方差分析中BC呈高度顯著性的結(jié)果一致，其中超聲溫度的響應(yīng)曲面較乙醇體積分?jǐn)?shù)的陡，說明超聲溫度對(duì)多酚得率的影響大于乙醇體積分?jǐn)?shù)。

綜上，綿馬貫眾多酚超聲輔助提取工藝各參數(shù)的適宜范圍為：料液比1∶(30～32)、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%～50%、超聲溫度60～65 ℃、超聲時(shí)間35～40 min。

通過求導(dǎo)，確定綿馬貫眾多酚的最佳提取工藝為：料液比1∶31.05、乙醇體積分?jǐn)?shù)47.47%、超聲溫度62.27 ℃、超聲時(shí)間37.76 min，在此條件下，綿馬貫眾多酚得率的理論值為9.311%。

2.3 工藝驗(yàn)證

綜合考慮，將綿馬貫眾多酚的最佳提取工藝調(diào)整為：料液比1∶31、乙醇體積分?jǐn)?shù)47%、超聲溫度62 ℃、超聲時(shí)間38 min。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，綿馬貫眾多酚得率分別為9.36%、9.22%、9.28%，平均得率為9.287%，與理論值相差0.024%。說明該提取工藝穩(wěn)定、可行，可用于綿馬貫眾多酚的提取。

2.4 抗氧化活性

綿馬貫眾多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力如圖7所示。

圖7 綿馬貫眾多酚對(duì)DPPH自由基(a)、ABTS自由基(b)的清除能力

由圖7可知，隨著濃度的增加，綿馬貫眾多酚和VC對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除率均逐漸升高。當(dāng)濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，綿馬貫眾多酚和VC對(duì)DPPH自由基的清除率分別為73.5%、75.3%，對(duì)ABTS自由基的清除率分別為69.8%、73.1%，無顯著差異。說明綿馬貫眾多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)，且在高濃度(2.0 mg·mL-1)時(shí)清除能力接近于VC。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化綿馬貫眾多酚的超聲輔助提取工藝，并通過測定綿馬貫眾多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力，評(píng)價(jià)其抗氧化活性。確定綿馬貫眾多酚的最佳提取工藝為：料液比1∶31(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)47%、超聲溫度62 ℃、超聲時(shí)間38 min，在此條件下，綿馬貫眾多酚得率為9.287%，與理論值(9.311%)接近。綿馬貫眾多酚具有很強(qiáng)的抗氧化活性，當(dāng)濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，綿馬貫眾多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力接近于VC。綿馬貫眾多酚的抗氧化活性可能是由一種酚類或幾種酚類共同發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步深入研究。