4種殺菌劑對煙草靶斑病菌的抑菌活性

孫美麗，汪漢成，郭沫言，蔡劉體，劉亭亭，陸 寧，史彩華

(1.長江大學 農學院，湖北 荊州 434025；2.貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550081)

0 引言

【研究意義】由立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的煙草靶斑病(Tobacco target spot)是煙葉旺長期易發生的真菌性病害，造成葉片褪綠、輪紋等癥狀，嚴重時可形成連片融合病斑，病斑壞死部分易碎形成穿孔，導致煙葉失去經濟價值[1-2]。立枯絲核菌除危害煙草外，還可引起煙草立枯病[3]、水稻紋枯病[4]等多種病害。該病原寄主范圍廣泛，包括煙草、水稻、馬鈴薯、甜菜等260余種作物[3-6]。2018—2021年，煙草靶斑病在云南、貴州等煙葉主產區危害嚴重[7]，局地損失高達80%以上，存在廣泛傳播與流行的風險，建立綠色高效的防控技術體系意義重大。【前人研究進展】國內外學者分別從農業防治[8]、生物防治[9]等不同角度研發了大量防控技術，但均存在防治成本高、防效不顯著、費工費時等缺陷。化學防控病蟲害仍然是煙農最青睞的方法，經濟高效，而且省工省時，是植物病害最為經濟、有效的防控措施。生產上，有機和無機殺菌劑常被用于防治立枯絲核菌引起的植物病害[10-11]，如井岡霉素(Jiangangmycin)、苯醚甲環唑(Difenoconazole)等。【研究切入點】由于我國煙草特殊的農藥登記政策，目前，國內煙草上登記防控煙草靶斑病的藥劑僅有井岡霉素，該藥劑對靶斑病具有較好預防作用，但病情嚴重時仍難以控制。同時，煙農習慣性將用于防控煙草赤星病的菌核凈(Dimethachlon)和代森錳鋅(Mancozeb)用來防控包括靶斑病在內的多種真菌性病害。【擬解決的關鍵問題】測定苯醚甲環唑、嘧菌酯、菌核凈和代森錳鋅4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌絲生長和菌核形成的生物活性，并在田間進行藥效評價，為煙草靶斑病防控替代藥劑的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地點及品種 田間藥劑試驗于2020年8月中旬在貴州省畢節市黔西縣高坡村煙田進行，供試品種為云煙87，煙草種子購自畢節市煙草公司黔西縣分公司。

1.1.2 供試菌株及培養基 煙草靶斑病菌菌株BEZ11、BEZ13和J203，由貴州省煙草科學研究院微生物實驗室前期分離、鑒定。測試培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基)。

1.1.3 供試藥劑及器械 96.80%苯醚甲環唑(Difenoconazole)原藥購自山東壽光雙星農藥有限公司，96%嘧菌酯(Azoxystrobin)原藥購自南京百慕達生物科技有限公司，90%菌核凈(Dimethachlon)原藥購自浙江禾益農化有限公司，85%代森錳鋅(Mancozeb)原藥購自杜邦(中國)集團有限公司。

分別購置10%苯醚甲環唑水分散粒劑(WG，商品名：勢麗，一帆生物科技集團有限公司)、25%嘧菌酯懸浮劑(SC，商品名：阿加西，鹽城利民農化有限公司)、40%菌核凈可濕性粉劑(WP，商品名：禾益，江西禾益化工股份有限公司)和80%代森錳鋅可濕性粉劑(WP，商品名：大生，陶氏益農農業科技有限公司)，用于田間藥效試驗。多功能噴霧施肥器(型號：DSF01A-20-100)，購自貴州黔豐源農業科技開發有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同藥劑對靶斑病菌菌絲生長的抑制作用 采用菌絲生長速率法[12]測定。將代森錳鋅溶于無菌水、嘧菌酯和苯醚甲環唑溶于甲醇、菌核凈溶于丙酮中，均分別配成1.0×104mg/L的母液，于4℃黑暗條件下保存，備用。殺菌劑的最終測試質量濃度：苯醚甲環唑0 mg/L、0.31 mg/L、0.63 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L；嘧菌酯0 mg/L、6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L；菌核凈0 mg/L、0.16 mg/L、0.31 mg/L、0.62 mg/L、1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L；代森錳鋅0 mg/L、9.38 mg/L、18.75 mg/L、37.5 mg/L、75 mg/L、150 mg/L、300 mg/L。以添加相同體積的甲醇、丙酮處理作為空白對照，其中甲醇、丙酮的體積分數均小于0.25%，此濃度溶劑均不影響靶斑病病菌菌絲的生長。將供試菌株在PDA培養基上活化，7 d后在菌落邊緣制備直徑為5 mm的菌碟，接種于不同濃度梯度含藥平板中央，各處理3次重復，接菌后將平板置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養。待對照菌落直徑長至2/3培養皿直徑時，采用“十字交叉”法測量菌落直徑，計算各藥劑不同劑量下對病原菌菌絲生長的抑制率[13]。

抑制率= [(對照菌落直徑-5 mm)-(處理菌落直徑-5 mm)]/(對照菌落直徑-5 mm)× 100%

1.2.2 不同藥劑對靶斑病菌菌核形成的抑制作用 采用稱重法[14]測定，將1.2.1中培養的平皿繼續置于25℃恒溫培養箱中黑暗培養，50 d后從各平板上挑取褐色菌核稱重，計算各藥劑不同劑量下對病原菌菌核形成的抑制率。

1.2.3 對煙草靶斑病的田間防效 選取煙株長勢一致的煙田劃分小區，隨機排列，每小區20株煙株，重復3次。10%苯醚甲環唑WP、25%嘧菌酯SC、40%菌核凈WP和80%代森錳鋅WP的田間用量分別為60 g/667m2、40 mL/667m2、120 g/667m2和200 g/667m2，于煙草靶斑病零星出現病斑時開始用藥，采用多功能噴霧施肥器均勻噴施葉片表面，直至液滴流失。以噴施等量清水處理為對照，小區之間設保護行。每處理施藥前在煙株相同部位分別標記8個病斑，并量取病斑直徑。施藥后9 d，分別再次量取各標記病斑的直徑，計算藥劑對病害擴展的抑制率。同時各小區隨機選擇8株煙株，參照煙草靶斑病病害分級標準調查各處理的病情指數[15]，計算各藥劑對煙草靶斑病的防效。

病斑抑制率= [1-(處理區病斑直徑擴增值/對照區病斑直徑擴增值)]×100%

病情指數=Σ(各級病葉數×相對級數值)/(調查總葉數×最高病級值)×100

防治效果= [1-(處理區病情指數增長值/對照區病情指數增長值)]×100%

1.3 數據處理

采用Excel 2019對試驗數據進行處理，以殺菌劑質量濃度對數值為橫坐標，以對病原菌菌絲生長抑制率的幾率值為縱坐標，建立毒力回歸方程，根據毒力回歸方程計算有效抑制中濃度(EC50)值和相關系數[16]。使用DPS 7.0.5.8進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同藥劑對靶斑病菌菌絲生長的抑制作用

由表1可見，4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌絲生長均表現出不同抑菌活性，其中抑菌活性最強的是菌核凈，其EC50值為1.57～2.00 mg/L，平均值為(1.72±0.25)mg/L；嘧菌酯次之，其EC50值為14.13～16.68 mg/L，平均值為(15.71±1.38)mg/L；苯醚甲環唑稍弱，其EC50值為13.81～18.38 mg/L，平均值為(16.80±2.59)mg/L；代森錳鋅最弱，其EC50值為13.88～35.87 mg/L，平均值為(24.77±11.10)mg/L。

表1 供試4 種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌絲生長的抑制作用Table 1 Inhibition effect of four fungicides against mycelium growth of R. solani

此外，煙草靶斑病菌不同菌株對同種藥劑的敏感性存在差異。其中，對代森錳鋅的敏感性差異最大，菌株J203的EC50值是菌株BEZ13的2.58倍；其次是苯醚甲環唑，菌株J203的EC50值是菌株BEZ13的1.33倍；相比而言，不同菌株對嘧菌酯和菌核凈的敏感性差異較小。

2.2 不同藥劑對靶斑病菌菌核形成的抑制作用

由表2可見，在測試濃度范圍內，4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌核的形成均表現不同的抑制活性。在50 d菌核形成期內，抑制活性最強的藥劑為菌核凈，在2.5 mg/L處理時的抑制率為100%；其次是嘧菌酯和苯醚甲環唑，嘧菌酯藥劑濃度在12.5 mg/L、50 mg/L和100 mg/L處理時的抑制率均為100%，苯醚甲環唑藥劑濃度在5 mg/L處理時的抑制率為(98.59± 2.45)%；代森錳鋅的抑制作用相對較弱，在18.75 mg/L處理時的抑制率為100%。

表2 供試4 種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌核形成的抑制作用 Table 2 Inhibition effect of four fungicides against sclerotium formation of R. solani

2.3 不同藥劑對煙草靶斑病的田間防效

從表3看出，4種藥劑施藥后第9 天的防治效果，40%菌核凈WP 120 g/667m2、25%嘧菌酯SC 40 mL/667m2、10%苯醚甲環唑WG 60 g/667m2及80%代森錳鋅WP 200 g/667m2處理，對靶斑病的防效分別為90.59%、61.76%、52.12%和13.41%；對病斑擴展的抑制率分別為53.55%、75.10%、64.09%和7.31%。

表3 4 種殺菌劑對煙草靶斑病的田間防效Table 3 Control efficacy of four fungicides against target spot in tobacco field

3 討論

采用生物學測定法并結合田間試驗發現，抑制煙草靶斑病菌菌絲生長活性較強的殺菌劑有菌核凈、嘧菌酯和苯醚甲環唑；同時發現代森錳鋅、嘧菌酯和菌核凈對其菌核的形成也有較強的抑制活性；田間對靶斑病防效較好的殺菌劑為菌核凈、嘧菌酯和苯醚甲環唑。

抑制菌絲生長是病害防治藥劑篩選的重要依據。已有諸多關于殺菌劑對立枯絲核菌敏感性研究的報道，而對煙草靶斑病菌敏感性的研究卻報道較少。研究發現，菌核凈抑制煙草靶斑病菌菌絲生長的EC50值為(1.72±0.25)mg/L，與汪漢成等[17]對煙草立枯病菌的敏感性(1.31±0.14)mg/L及白慶榮等[18]對高山紅景天立枯病菌的敏感性(1.58±0.12)mg/L的測定結果基本一致；嘧菌酯抑制其菌絲生長的EC50值為(15.71±1.38)mg/L，與余嘉[19]對玉米紋枯病菌的敏感性(16.09±3.47)mg/L的測定結果基本一致；代森錳鋅抑制其菌絲生長的EC50值為(24.77±10.99)mg/L，與張燕南等[20]對融合群水平上的棉花立枯病菌的敏感性29.15 mg/L的測定結果基本一致。伏穎等[13]采用菌絲生長速率法和抑菌圈法測定煙草靶斑病菌對10種藥劑的敏感性，2種方法均發現菌核凈對菌絲生長的抑制作用最強，這與該試驗結果一致，進一步驗證測定結果的正確性。

菌核是煙草靶斑病菌越冬和翌年初侵染的主要組織[21]，抑制菌核形成也是煙草靶斑病防治藥劑篩選的重要依據。已有諸多關于殺菌劑對立枯絲核菌菌核形成的研究報道，然而對煙草靶斑病菌菌核形成研究卻報道較少。研究發現，菌核凈5 mg/L處理對菌核形成的抑制率高達100%，與汪漢成等[17]對煙草立枯病菌的菌核抑制率測定結果(100%)一致；嘧菌酯50 mg/L處理對菌核形成的抑制率高達100%，與KUMARI等[22]測定嘧菌酯對立枯絲核菌生防的菌核抑制率(96%)結果基本一致；苯醚甲環唑5 mg/L處理對菌核形成的抑制率高達98.59%，與汪漢成等[17]對煙草立枯病菌的菌核抑制率(97.97±2.64)%測定結果基本一致。18.75 mg/L代森錳鋅處理對菌核形成的抑制率高達100%，而目前對代森錳鋅抑制立枯絲核菌菌核形成的研究較少，代森錳鋅質量濃度為9.38 mg/L處理的抑制率為58.35%，與汪漢成等[17]研究代森錳鋅質量濃度為10 mg/L時對立枯絲核菌菌核生長抑制率為(43.58±31.87)%的結果基本一致。綜上，4種殺菌劑對煙草靶斑病菌菌核形成的抑制準確可靠。

田間藥效試驗是檢驗藥劑防治病害的重要環節。試驗發現，嘧菌酯40 mL/667m2處理的防效可達90.59%，與馬鈴薯每100 kg種薯施用20 mL 25%嘧菌酯SC防控黑痣病的防效86%結果接近[5]。菌核凈常被用于赤星病的防控，少有關于其對煙草靶斑病的防效評價，試驗發現其田間對煙草靶斑病也具有較好的防效，在120 g/667m2處理時防效高達90.59%。苯醚甲環唑在60 g/667m2處理時防效達64.09%，與4.5 g/667m2的30%苯醚甲環唑·丙環唑SC對水稻紋枯病的防效71.43%接近[23]。代森錳鋅是多作用位點殺菌劑，對包括立枯絲核菌的諸多病害具有預防作用[20，24-25]，研究發現，在靶斑病開始發生后，200 g/667m2劑量時的防效較低，為此，該藥劑不適合在病害發生后使用。此外，基于煙草靶斑病病斑擴展的抑制率與基于病情指數防效評價，獲得的4種殺菌劑對煙草靶斑病的防效基本一致，病情指數調查工作量較大，且易存在人為誤差；相比而已，基于病斑擴展的調查方法操作簡便、更為精準，可以用于今后其他藥劑的田間藥效評價。

4 結論

苯醚甲環唑、嘧菌酯、菌核凈和代森錳鋅4種殺菌劑對靶斑病菌菌絲生長和菌核形成的具有抑制作用，對靶斑病具有一定的田間防效。研究結果豐富了用于煙草靶斑病防治藥劑選擇的種類，考慮到菌核凈和代森錳鋅存在超標的風險，建議相關農藥企業或煙草農藥登記管理部門將苯醚甲環唑和嘧菌酯納入煙草靶斑病防控的候選藥劑。