微流池多光程土壤有效態氮磷測定方法研究

位文濤 李振峰 李林澤 蘇 睿 李曉冬陳永起 VIJAYA Raghavan 胡建東，5*

(1.河南農業大學 機電工程學院，鄭州 450002；2.河南省農業激光技術國際聯合實驗室，鄭州 450002；3.河南問道光電科技有限公司，鄭州 450002；4.McGill大學 生物資源工程系，加拿大 蒙特利爾 H9X 3V9；5.小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002)

2020年《第二次全國污染源普查公報》中水體污染源分布數據表明，農業面源總氮(TN)和總磷(TP)污染占地表水體污染總負荷36.79%和50.23%，盡管較第一次全國污染源普查公報中總氮和總磷排放負荷57.2%和67.4%有所下降，但農業面源污染仍然是當前地表水體污染主要來源。河南省水體污染農業源分布狀況與全國占比基本一致，第二次河南水體污染物普查數據表明，河南總氮排放17.4萬t，占總負荷44.96%，總磷排放為1.8萬t，占總負荷31.41%。農業面源污染問題已經對現代農業和社會經濟可持續發展、農業生態環境安全和農產品質量安全構成了嚴重威脅[1]。

實驗室常規紫外可見分光光度法土壤有效態氮磷測定涉及復雜的前處理和測定過程，不適合現場土壤有效態氮磷的測試。在現場測試方法中，近紅外光譜[2]、激光誘導擊穿光譜[3-4]和電化學傳感器[5]等用于土壤有效態氮磷測試的研究報道很多，但上述測定方法需要建立復雜的化學計量學模型，通過復雜的計算才能獲得結果，而且這些測試方法的穩定性和重復性與實驗室常規紫外可見分光光度法的測試結果差距明顯，必須通過復雜的校正才能夠被使用，在實際生產實踐中，這些測試結果的差異導致在精準農業和農業面源污染防治應用中無法有效銜接原來實驗室測試數據。為了提高土壤有效態氮磷分析效率，科學家們紛紛研究流動分析方法，并將流動分析方法應用于土壤有效態氮磷測試。根據流動分析方法原理可分類為擴散對流和強迫對流流動分析方法，按具體的實現途徑分為流動注射分析、順序流動分析、多注射泵注射分析、多電磁閥注射分析和多蠕動泵注射分析等[6]。其中，流動注射分析消耗試劑量小，產生廢液量少[7-8]，是應用最成功的土壤和環境中氮磷分析方法。陳德華等[9]用流動注射分析同時完成水中磷酸鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽測量自動化，與國際分光光度分析方法相比，相對標準偏差均在0.29%～15.7%，加標回收率93.0%～102%，能夠滿足海洋監測規范標準要求。楊靖民等[10]應用間隔流動分析儀實現了重氮偶合染色方法的土壤硝態氮測量自動化，能夠有效地提高分析速度，測試土壤中硝態氮和亞硝態氮加標回收率98.0%～101.8%，檢測限分別為0.2和200 μg/kg。賀舒文等[11]應用流動注射分析技術實現了靛酚藍比色分析方法自動化，實現了海水中銨氮在線監測分析，有效降低了運行成本。

流動分析方法測試速度快[12-13]，屬于瞬態測量，本論文在研究流動分析方法基礎上提出了微流池多光程流動分析方法，實現樣品從瞬態測定到穩態測定，并采用該方法研制了土壤有效態氮磷分析儀。該儀器中專門設置了化學反應腔，被測樣品和所需要的試劑依次進入化學反應腔并分別在不同的反應條件下進行。采用蠕動泵擾動化學反應腔中的反應物，讓反應物在流路過程中實現擾動-擴散流動過程。與通常的擴散對流和強迫對流不同，反應物可以設定多次擾動，使之發生完全徹底的化學反應，然后反應物進入恒溫光電探測單元，確保了測試結果的靈敏度、檢出限和穩定性，最大限度地使測試結果接近實驗室紫外可見分光光度計的值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

微流池多光程土壤有效態氮磷分析儀(河南農業大學)，D-9系列紫外可見分光光度計(南京菲勒儀器有限公司)，HY-4A調速多用振蕩器(湖南前沿科技有限公司)，GL124I-1SCN萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

檸檬酸鈉、水楊酸鈉、硝普鈉、氫氧化鈉、二氯異氰脲酸鈉、Brij-35、磷酸、十水二磷酸鈉、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸肼、磺胺、N-1-萘基乙二胺鹽酸、鉬酸銨、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、磷酸二氫鉀、濃硫酸、十二烷基硫酸鈉、氯化鈷均為分析純，實驗用水為二次去離子水，GBW(E)083113銨氮標準物質，BWZ6607-2016硝態氮標準物質、BW081622-2磷酸鹽標準物質。

1.2 實驗原理

微流池多光程土壤有效態氮磷分析儀由定量化取樣單元、微流池多光程反應腔、模塊化光電探測單元和自動化清洗系統4個模塊構成。微流池多光程流動分析方法原理如圖1所示，采用了兩個多通道電磁閥切換多個土壤氮磷樣品和試劑，高精度注射泵提取土壤氮磷樣品和試劑，取樣環防止在樣品進樣過程中發生污染。取樣環和多通道切換閥相連，程序控制樣品和試劑自動進入反應腔。蠕動泵的正反轉擾動反應腔中的反應物，加速其化學反應發生過程，提供了近穩態的測量方法。夾管閥控制反應樣品前后大氣泡的進入時間，而液位傳感器監測液體的位置，從而實現連續信號采集與處理，所測量結果直接在顯示屏上顯示。小氣泡把同一個樣品分割成多段進行測量，有效地提高了測量準確性。

圖1 微流池多光程流動分析方法原理示意圖Figure 1 Principle diagram of a measurement system using a micro-tube with a multi-optical length based flow analysis method.

模塊化光電探測單元內嵌微流池，光程長可設定10、20和30 mm三種，滿足了不同靈敏度測試對象需求。三種波長的發光芯片封裝在一個LED管里，程序控制選擇不同工作波長，用于不同種類物質的測定。模塊化光電探測單元采用PIC32MI系列微處器，光電信號通過放大器放大之后轉換成數字信號并與主控制器通過RS485接口進行傳輸。儀器系統內部通過RS232接口和RS485協議對注射泵、蠕動泵和多通道切換閥進行管理，使測試數據能夠實時上傳到信息共享平臺，微流池多光程土壤有效態氮磷分析儀見圖2。

圖2 微流池多光程土壤有效態氮磷分析儀Figure 2 Soil available nitrogen and phosphorus analyzer using a Micro-tube with multi-optical length.

1.3 樣品處理與制備

實驗樣品為廣東省韶關市農業科學研究所現場采取的9個土樣和北京市農林科學院提供的17個土樣，風干后各稱取過2 mm篩的土樣5 g(精確至0.001 g)，放入150 mL的三角瓶中，加入50 mL去離子水，轉速為180～200 r/min振蕩30 min，然后立即用無磷濾紙過濾，未澄清的溶液用高速離心機離心過濾或者用濾膜過濾待測液(過濾液應該在4 h內完成檢測，最長不超過8 h，以免過濾液出現渾濁沉淀)。該待測液用于檢測土壤中有效態銨態氮、硝態氮和磷含量。

1.4 實驗與應用

對廣東省韶關市農業科學研究所(113°45′36″E，24°53′49″N)現場采集9個土壤樣品(編號S1～S9)進行處理，對土樣中有效態銨態氮和硝態氮含量進行測定。

2 結果與討論

2.1 影響氮磷測定的光源穩定性實驗

微流池多光程土壤有效態氮磷測定采用了組合LED芯片，可以程序控制選擇550和660 nm波長，但LED峰值波長隨著工作時間延長或者LED驅動電流變化，峰值波長發生紅移。微流池多光程土壤有效態氮磷測定系統采用了精密場效應管的恒流源電路動態調整LED驅動電流，同時交替測量空白和樣品的透射光強，極大地降低了工作時間對LED性能影響，確保了氮磷測定結果的穩定性。實驗采用10 g/L的硫酸銅溶液和4 g/L的氯化鈷溶液分別測定550和660 nm波長的LED光強，測試時間為30 min，重復5次，實驗結果見圖3，其中550和660 nm波長LED光強的相對標準偏差(RSD)為0.10%和0.13%。

圖3 組合光源穩定性實驗Figure 3 Stability of a compact LED light source.

2.2 方法檢出限與線性范圍

測定11次空白溶液的吸光度結果如表1所示，檢出限(LOD，mg/L)的計算公式為LOD=3S/b，(S，mg/L為11次測定值的標準偏差，b為接近LOD標準曲線的斜率)。通過計算，銨態氮、硝態氮和磷的檢出限分別為0.008 6、0.009 4和0.007 8 mg/L。

表1 銨態氮、硝態氮和磷檢出限測定值Table 1 Determination of the detection limit of ammonium nitrogen，nitrate nitrogen and phosphorus

取銨態氮、硝態氮和磷的標準溶液稀釋至1、2、3、4 mg/L，根據銨態氮、硝態氮和磷標準溶液的吸光度和空白溶液吸光度建立標準曲線的R2分別為0.999 8、0.999 7和0.999 4，如圖4所示。

圖4 標準曲線(a)銨態氮；(b)硝態氮；(c)磷Figure 4 Standard curves.(a)Ammonium nitrogen；(b)Nitrate nitrogen；(c)Phosphorus

2.3 樣品測定結果

在標準曲線建立后，采用微流池多光程土壤有效態氮磷分析儀對廣東省韶關市農業科學研究所9個土壤樣品進行測定，同時分別通過紫外可見分光光度計進行對比測試。銨態氮和硝態氮測定值如表2、3所示，R2分別為0.946 1和0.995 4，如圖5所示。

圖5 韶關土樣的測定值對比(a)銨態氮；(b)硝態氮Figure 5 Comparison of measured values of soil samples from Shaoguan.(a) ammonium nitrogen；(b) nitrate nitrogen

表2 微流池多光程分析儀與紫外可見分光光度計測定土壤銨態氮值對比Table 2 Comparison of the measured values of ammonium nitrogen in soil using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

表3 微流池多光程分析儀與紫外可見分光光度計測定土壤硝態氮值對比Table 3 Comparison of measured values of nitrate nitrogen in soil using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

北京市農林科學院提供的17個測試土樣(均通過紫外可見分光光度計測試)，8個硝態氮測試土樣(編號B 1～8)和9個磷測試土樣(編號B 9～17)通過微流池多光程土壤有效態氮磷分析儀進行分析對比，土壤樣品中硝態氮和磷測定值如表4、5所示，R2分別為0.980 1和0.888 9，如圖6所示。

表4 用微流池多光程分析儀和紫外可見分光光度計的測定土樣中硝態氮值Table 4 Measured values of nitrate nitrogen in soil samples using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

表5 土樣中磷用微流池多光程分析儀和紫外可見分光光度計的測定值Table 5 Measured values of phosphorus in soil samples using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

圖6 土樣測定值對比(a)硝態氮；(b)磷Figure 6 Comparison of measured values of soil samples.(a)Nitrate nitrogen；(b)Phosphorus

2.4 方法精密度與準確度

微流池多光程土壤有效態氮磷分析儀在進行銨態氮、硝態氮和磷重復性測定值如表6所示。在樣品中加入不同濃度標準物質進行加標回收實驗，測定結果見表7。結果表明，本方法測試銨態氮、硝態氮和磷的相對標準偏差(RSD，n=7)分別為0.80%、5.7%和0.90%，加標回收率在92.0%～103%，滿足現場測試要求。

表6 銨態氮、硝態氮和磷重復性測定值Table 6 Repeatability of ammonium nitrogen，nitrate nitrogen and phosphorus /(mg·L-1)

表7 微流池多光程流動分析方法加標回收率Table 7 Spiked recoveries of micro-tube with multi-optical length flow analysis method

3 結論

分析了微流池多光程流動分析方法的組成結構，并測定了土壤中的有效態氮和磷，銨態氮、硝態氮和磷的檢出限分別為0.008 6、0.009 4和0.007 8 mg/L。測試了廣東省韶關市農業科學研究所現場采取的土樣和北京市農林科學院提供的土樣，并與紫外可見分光光度計的測定結果對比分析，結果表明本方法相對標準偏差RSD分別為0.80%、5.7%和0.90%，加標回收率在92.0%～103%，單樣品平均測試時間6 min。采用微流池多光程流動分析方法檢測土壤中的有效態氮磷，本方法具有誤差較小，檢出限低，自動化程度高，試劑用量少等特點，對大批量樣品的檢測具有不可比擬的優勢。