淀粉樣前體蛋白/早老素1轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)中過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α的表達(dá)及意義

張李娟，趙舒祥，王若溪，卜勇軍，楊 磊，原志慶，李文強(qiáng)，石如玲,

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；4.河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 新鄉(xiāng) 453002)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是以進(jìn)行性認(rèn)知障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)在大腦沉積形成老年斑是AD的主要病理特征之一[1]。過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體α(peroxisome proliferators activated receptors α，PPARα)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與脂質(zhì)代謝、能量平衡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)遞質(zhì)釋放等多種生物過(guò)程的調(diào)控[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦組織內(nèi)PPARα水平呈低表達(dá)，PPARα調(diào)控淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的裂解過(guò)程，減少Aβ生成[4-6]。APP/早老素1(presenilin 1，PS1)轉(zhuǎn)基因小鼠是常見(jiàn)的AD動(dòng)物模型之一，攜帶人類突變APP Swedish(K595N/M596L)和PS1 deltaE9基因，能較好地模擬AD病理特征和大腦認(rèn)知功能狀態(tài)，如出現(xiàn)Aβ沉積形成的老年斑、學(xué)習(xí)記憶功能障礙等[7-8]。但目前針對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)PPARα表達(dá)及相關(guān)代謝特征的研究較少。基于此，本研究以5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠為研究對(duì)象，觀察其行為學(xué)、腦組織形態(tài)學(xué)及PPARα表達(dá)和相關(guān)生物化學(xué)代謝指標(biāo)的變化，探討PPARα在AD發(fā)病機(jī)制中的作用，以期為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD模型提供更多分子水平依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5月齡雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因C57BL/6J-TgN(APP/PS1)ZLFILAS小鼠(實(shí)驗(yàn)組)及同遺傳背景同月齡雄性C57BL/6J野生型小鼠(對(duì)照組)各10只，體質(zhì)量21～24 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXX(京)2014-0004]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃，濕度50%～60%，晝夜12 h/12 h，自由攝食飲水，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Aβ抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，APP抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PPARα、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1(carnitine acyltransferase 1，CPT1)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，脂酰輔酶A氧化酶1(acyl CoA oxidase 1，ACOX1)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，β-actin抗體購(gòu)自上海齊合生物技術(shù)有限公司，山羊抗兔及山羊抗小鼠過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自杭州賢至生物科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO公司；EthoVision XT 8型Morris水迷宮跟蹤成像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Noldus公司，電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物處理及取材2組小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)后，應(yīng)用Morris水迷宮測(cè)定小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，2組小鼠分別取3只，禁食12 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，40 g·L-1多聚甲醛全身灌流固定，斷頭取腦，用于腦組織中Aβ免疫組織化學(xué)染色。其余7只小鼠取股動(dòng)脈血1 mL，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存，用于血清TC、TG測(cè)定；然后斷頭處死小鼠，分離大腦皮質(zhì)、肝組織，置于液氮中，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試2組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力2組小鼠于適應(yīng)飼養(yǎng)后行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，持續(xù) 5 d，包括定位航行和空間探索2個(gè)階段。定位航行實(shí)驗(yàn)：水下平臺(tái)置于第3象限(目標(biāo)象限)固定位置不變，每只小鼠分別從4個(gè)象限中央作為入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，當(dāng)小鼠爬上平臺(tái)并在平臺(tái)上逗留5 s，記錄小鼠找到平臺(tái)所需的時(shí)間，即為逃避潛伏期，每天訓(xùn)練4次，每次間隔20 min，持續(xù)4 d。空間探索實(shí)驗(yàn)：第5天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，移除平臺(tái)，將小鼠從第1象限放入水中，記錄90 s內(nèi)小鼠在目標(biāo)象限游動(dòng)的時(shí)間。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)2組小鼠腦組織中Aβ沉積將多聚甲醛固定的腦組織進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度4.0 μm)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，用檸檬酸緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加Aβ一抗(滴度1500)，4 ℃孵育過(guò)夜；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(滴度11 000)，室溫孵育50 min；DAB顯色，Aβ陽(yáng)性呈棕褐色。顯微鏡下觀察并用Case Viewer軟件掃描染色情況，觀察腦皮質(zhì)和海馬組織中Aβ陽(yáng)性斑塊。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)2組小鼠腦皮質(zhì)、肝組織中PPARα、APP、ACOX1及CPT1蛋白表達(dá)取 30 mg 腦皮質(zhì)或肝組織，加入300 μL裂解液裂解組織，冰浴勻漿，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，測(cè)定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，取20 μg蛋白，4 ℃條件下轉(zhuǎn)膜，將膜置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉中封閉后，分別加入PPARα一抗(滴度1500)、APP一抗(滴度11 000)、ACOX1一抗(滴度1500)、CPT1一抗(滴度1500)，4 ℃緩慢搖動(dòng)孵育14 h；然后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(滴度14 000)，室溫孵育2 h。將電化學(xué)發(fā)光液均勻加在膜的正面，應(yīng)用Amersham Imager 600成像分析儀采集圖像，Image J軟件測(cè)定目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 2組小鼠血清中TG、TC水平測(cè)定采用甘油磷酸氧化酶法測(cè)定2組小鼠血清TG水平，膽固醇氧化酶法測(cè)定血清TC水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力比較結(jié)果見(jiàn)表1。2組小鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練時(shí)間增加均逐漸縮短；實(shí)驗(yàn)組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期短于對(duì)照組，但2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間短于對(duì)照組，但2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組小鼠的逃避潛伏期和在目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間比較

2.2 2組小鼠腦組織中Aβ沉積情況比較結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組小鼠腦組織中未見(jiàn)到Aβ陽(yáng)性斑塊，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)有大量大小不等的Aβ陽(yáng)性斑塊。

A：對(duì)照組；B：實(shí)驗(yàn)組。

2.3 2組小鼠腦皮質(zhì)中PPARα、APP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。實(shí)驗(yàn)組小鼠腦皮質(zhì)中PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，APP蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 2組小鼠腦皮質(zhì)中PPARα、APP蛋白表達(dá)

表2 2組小鼠腦皮質(zhì)中PPARα、APP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 2組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1、CPT1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1、CPT1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 2組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1和CPT1蛋白表達(dá)

表3 2組小鼠肝組織中PPARα、ACOX1和CPT1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 2組小鼠血清中TG、TC水平比較結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清TG水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠血清TC水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 2組小鼠血清中TG、TC水平比較

3 討論

AD是老年癡呆最常見(jiàn)的類型，是老年人失能和死亡的主要原因，但AD的發(fā)病機(jī)制并未明晰。研究顯示，AD發(fā)病與遺傳因素、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種因素有關(guān)，這些致病因素可引起Aβ代謝異常，導(dǎo)致Aβ水平過(guò)高，進(jìn)而引起老年斑沉積等病理改變及大腦功能障礙[1]。目前，AD在臨床上尚無(wú)有效防治措施，進(jìn)一步深入探索AD發(fā)病機(jī)制和潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)有效預(yù)防和治療該病有重要意義。

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠廣泛應(yīng)用于AD發(fā)病機(jī)制研究，文獻(xiàn)報(bào)道，APP/PS1小鼠3月齡時(shí)出現(xiàn)認(rèn)知行為學(xué)變化，5月齡時(shí)腦內(nèi)存在淀粉樣斑塊沉積[9]。本研究結(jié)果顯示，5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)淀粉樣斑塊顯著增多，提示5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠可較好地模擬出AD特征性病理變化。此外，本研究中Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠逃避潛伏期略長(zhǎng)于對(duì)照組，而且在目標(biāo)象限游動(dòng)時(shí)間較短，但2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這說(shuō)明5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力僅有輕微降低，認(rèn)知功能損害較輕微。因此，認(rèn)為5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因組小鼠已經(jīng)出現(xiàn)特征性病理改變及輕微認(rèn)知功能損傷。

PPARα屬于配體激活轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于全身多種組織。一些配體激活PPARα后可通過(guò)降低神經(jīng)炎癥、增強(qiáng)抗氧化防御、減少Aβ合成、促進(jìn)Aβ降解等多種機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[2-3,10-11]。研究顯示，AD患者腦內(nèi)PPARα mRNA水平降低[12-13]。還有研究顯示，PPARα基因敲除小鼠腦組織中Aβ生成增多，且小鼠的認(rèn)知功能下降[5,14]。因此，推測(cè)PPARα有望成為治療AD或其他神經(jīng)退行性疾病的潛在靶點(diǎn)。另有研究顯示，PPARα表達(dá)水平與APP有關(guān)，APP是一種跨膜糖蛋白，除作為Aβ前體蛋白經(jīng)淀粉樣裂解產(chǎn)生Aβ外，APP還具有多種生理功能。在APP基因拷貝數(shù)增多的早發(fā)性AD患者腦內(nèi)PPARα表達(dá)降低，且PPARα與APP表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，小鼠或原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞過(guò)表達(dá)人源APP基因后也會(huì)引起PPARα表達(dá)下降[15]，提示APP可能參與了PPARα表達(dá)的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠腦皮質(zhì)中PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，APP蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，因此，推測(cè)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)PPARα表達(dá)降低的原因可能與APP基因水平升高有關(guān)。有研究顯示，PPARα通過(guò)上調(diào)α分泌酶表達(dá)促進(jìn)APP非淀粉樣途徑，減少Aβ生成；而PPARα基因敲除小鼠腦內(nèi)α分泌酶表達(dá)減少、Aβ生成增多[5]。因此，推測(cè)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中Aβ沉積增多的機(jī)制除與APP增多有關(guān)外，還可能與PPARα表達(dá)降低有關(guān)。

PPARα在調(diào)節(jié)脂肪酸分解代謝中具有重要作用，線粒體脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶CPT1和過(guò)氧化物酶體β-氧化關(guān)鍵酶ACOX1均受PPARα調(diào)控，PPARα激活后上調(diào)CPT1和ACOX1的表達(dá)[16-17]。另有研究報(bào)道，脂質(zhì)紊亂、高膽固醇和高TG水平可增加AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[18-19]。曾檳[20]研究報(bào)道，8月齡APP/PS1小鼠血清TG、TC水平顯著升高。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠比較，5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠血清TG水平顯著升高，且其肝臟組織中PPARα及其靶基因CPT1和ACOX1蛋白水平顯著升高。這說(shuō)明，5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠存在血脂升高、肝臟脂肪酸分解代謝加強(qiáng)等脂質(zhì)代謝紊亂，但目前尚不清楚APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠血清TG水平升高的原因，其肝臟組織中PPARα、ACOX1和 CPT1等表達(dá)升高是否與血清TG升高存在內(nèi)在因果關(guān)系尚不能確定。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中小鼠肝臟和腦皮質(zhì)中PPARα表達(dá)變化并不一致，其在肝組織中表達(dá)增多而在腦皮質(zhì)中表達(dá)卻降低，引起這一差異的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，5月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠存在系統(tǒng)性代謝紊亂，但小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力降低并不明顯，表明APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的代謝紊亂可能先于行為學(xué)損傷；另外，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)中PPARα表達(dá)降低、肝組織中PPARα及其靶基因CPT1和ACOX1蛋白表達(dá)升高，表明PPARα在AD發(fā)病機(jī)制中具有重要作用；基于此，PPARα及其靶基因有望成為AD早期診斷的潛在靶點(diǎn)。但關(guān)于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織和腦皮質(zhì)中PPARα表達(dá)變化并不一致的原因及代謝紊亂與其基因型之間的內(nèi)在聯(lián)系尚有待進(jìn)一步研究。