外源草酸對不同年限狗尾草種子萌發及生理生化的影響

徐 翠， 姜 娜， 曠思萍， 蔣金娟， 羅富成*， 祖艷群*

(1. 云南農業大學動物科學技術學院， 云南 昆明 650201； 2. 云南農業大學資源與環境學院， 云南 昆明 650201)

‘納羅克’非洲狗尾草(Setariasphacelata‘Narok’)是禾本科(Gramineae)狗尾草屬(Setaria)多年生草本植物，其牧草品質優良，干草產量可達16 500 kg·hm-2，不僅是亞熱帶、暖溫帶地區草業生產主要的牧草之一[1]，還是水土保持、邊坡植被恢復的地被植物[2]。‘納羅克’種子休眠程度較深，種子休眠是植物在長期進化過程中抵抗不良環境所形成的一種生態適應性，從種族繁衍、種質保持方面來看，種子休眠是一種非常有利的特性[3]，但作為播種材料，該種子要自然儲藏1～2年后才具備較高的發芽能力[4]，而種子活力水平往往與儲藏時間呈反比關系，意味著隨時間延長具有高活力水平的種子逐漸減少，這會給種子生產、人工草地建設帶來極大的挑戰[5]，針對狗尾草種子的休眠學者展開了一系列研究，如用物理方法去除稃片增強種子的呼吸作用，或用化學方法強酸強堿腐蝕種皮突破萌發障礙[6]。但在實際生產過程中，除了存在復合休眠外[7]，該牧草種子體積微小，導致休眠解除技術難以推廣且不易操作。

草酸(Oxalic acid)是生物體的一種代謝產物，廣泛分布于植物、動物和真菌體中，并在不同的生命體中發揮不同的功能[8]。研究表明，外源草酸在毫摩爾濃度水平具有極強的抗氧化性能[9]，通過抑制蔬果的木質素代謝和提高抗氧化酶系統，果實細胞膜透性增加趨勢被緩解，丙二醛含量降低，最終減緩果實成熟進程或延緩冷藏期內品質的下降[10]，因此在適當用量范圍內可以作為一種有效的抗氧化劑。而抗氧化劑和抗氧化酶的聯合作用可以有效清除種子休眠過程中ROS對細胞產生的損傷[11]。草酸處理誘導提高果實抗氧化酶活性，降低ROS水平和膜脂過氧化程度，有助于維持細胞膜結構的穩定性[12]。莊正等[13]發現低濃度外源草酸具有促進杉木(Cunninghamialanceolata)種子萌發及幼苗生長的作用，且對杉木幼苗無明顯傷害。而種子萌發過程也都伴隨著活性氧(ROS)的產生和積累[14]。ROS的過量積累會導致膜脂過氧化不斷加強，造成細胞膜結構破壞、電解質外滲和細胞膜受損，從而抑制種子的萌發[15-16]。丙二醛(MDA)是細胞膜質過氧化的產物，植物細胞中大量丙二醛加重細胞膜脂質過氧化，其含量越高，種子活力越低[17]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)作為抗氧化酶系統中重要物質，能通過清除體內多余的ROS保持其平衡。抗氧化酶的活性也與種子的萌發表現出顯著正相關性[18]，隨著抗氧化酶活性的提高，種子活力也會隨之增加[19]。糖分子作為一種信號分子參與許多植物激素如乙烯、細胞分裂素、生長素等的信號轉導途徑，調控種子萌發和幼苗生長的生理過程，在擬南芥(ThaleCress)的種子和幼苗中，可以在有外源葡萄糖的情況下促進種子的萌發。目前外源草酸的添加主要應用于蔬果的保鮮，緩解植物根系重金屬毒害等方面[20]，關于休眠種子的報道較少。因此本試驗預期將外源草酸作為一種抗氧化劑，研究外源草酸處理對‘納羅克’非洲狗尾草種子萌發的影響，進一步探討不同儲藏年限種子經草酸處理后種子萌發及生理生化的變化，以期為外源物質對休眠種子的深入研究奠定理論基礎，為揭示草酸提高種子萌發活力的機理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為自然儲藏0，1，2，3，4年的‘納羅克’非洲狗尾草種子(Setariasphacelata‘Narok’)，收獲時間為每年的9—10月，試驗室種子含水率分別為8.5%，7.4%，7.8%，7.9%，7.2%。采自于云南農業大學草業科學實踐教學基地，原始材料經種子重力分離機(荷蘭，Selecta Machinefabriek BV)清選，風力值為34 m·s-1，充分混勻后用作試驗材料。試驗于2020年1—6月完成，采用TTC(四氮唑)圖像法[21]測定種子生活力分別為84.4%，81.4%，64.0%，53.2%和10.6%。

1.2 試驗設計

儲藏0，1，2，3，4年的‘納羅克’非洲狗尾草種子用1.5%的硫酸銅消毒15 min，蒸餾水浸泡30 min，換水重復清洗3次[22]，用吸水紙吸干種子表面水分備用。選擇收獲當年的種子用于篩選草酸處理參數，以不同草酸濃度設置5個梯度(0，5，10，15，20，25 mmol·L-1)，不同處理時間設置4個梯度(0，5，15，25 min)，根據不同濃度和不同處理時間設置組合，每個處理3 g種子，加入50 mL相應濃度的草酸進行試驗，以浸入50 mL蒸餾水處理25 min的種子為對照。處理后的種子用蒸餾水清洗3次，并置于室內回干12 h，回干時室內溫度為22.6℃，結合發芽試驗確定最佳處理參數。

根據發芽指標選擇最佳處理參數，用于處理儲藏0—4年的‘納羅克’非洲狗尾草種子，測定處理后種子的發芽率、發芽勢、抗氧化酶活性、丙二醛含量和可溶性糖含量。待21 d種子發芽試驗結束后，測定種子發芽指數、活力指數和幼苗的生長情況。

1.3 指標測定與方法

1.3.1發芽試驗 發芽試驗采用紙上發芽法[23]。對于處理組和對照組的種子，各取100粒種子，重復3次，并將種子置于內有濕潤濾紙的培養皿中，于24 h光照的人工氣候箱中(25±1)℃進行發芽試驗，光照強度為180 Lx，逐日統計發芽數。分別在第7 d，第21 d統計種子的發芽勢和發芽率。待21 d發芽試驗結束后，將幼苗置于105℃的烘箱中殺青15 min，然后于80℃的烘箱中干燥24 h后，重復稱其干重至恒重，并按照下列公式計算種子的發芽指數和活力指數[6]。

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt)

活力指數(VI)=GI×S

式中：Dt為發芽時間(d)；Gt是與Dt相對應的每天發芽種子數；S表示發芽試驗結束時正常幼苗的單株干重(g)。

1.3.2幼苗生長測定 21天發芽試驗結束后，隨機選取10株幼苗，游標卡尺測量根長和苗高，保留兩位小數。

1.3.3種子生理指標測定 SOD活性采用NBT顯色法[24]；POD活性采用愈創木酚氧化法[24]；CAT活性采用H2O2法[25]；MDA含量采用TBA測定法[26]；可溶性糖含量采用蒽酮-硫酸試劑法[26]。

1.4 數據分析

所得數據使用Microsoft Excel 2010整理分析、Origin 2018作圖，采用SPSS 23.0進行單因素方差分析、線性回歸分析、相關性分析和主成分分析，Duncan方法檢驗各處理水平在0.05水平的差異性。

2 結果與分析

2.1 不同草酸濃度與處理時間對當年種子萌發的影響

草酸處理后，狗尾草種子的萌發指標與對照相比均有顯著提高(P<0.05)。隨著草酸時間的延長，狗尾草種子的發芽率逐漸升高，15和25 mmol·L-1的草酸處理25 min的發芽率較高，其發芽率分別為74.0%和84.0%；種子的發芽勢均在31.0%～65.0%之間，其中較高的兩個處理組合參數與發芽率相同，即15和25 mmol·L-1的草酸處理25 min，發芽勢分別為63.3%和64.3%；發芽指數與活力指數的變化相似，25 mmol·L-1的草酸處理25 min后種子的發芽指數，活力指數差異顯著，兩者分別為16.1和16.3，是對照的13.3倍和12.5倍(表1)。

表1 不同的草酸處理組合對收獲當年‘納羅克’種子萌發指標的影響Table 1 Effects of different oxalic acid treatments on germination indicators of ‘Narok’ seeds in the year of harvest

對狗尾草種子萌發特性與草酸濃度與處理時間的關系進行了多元回歸分析，處理時間是種子發芽特性解釋率最大的因子。處理時間對種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數存在極顯著正相關，而草酸濃度除與發芽指數呈顯著正相關外，與發芽率、發芽勢、活力指數也呈極顯著正相關(表2)。

表2 狗尾草種子萌發和草酸濃度與處理時間的多元線性回歸分析Table 2 Multi-linear regression analysis of seed germination and oxalic acid concentration and treatment time

2.2 不同儲藏年份種子萌發對草酸處理的響應

草酸處理后，收獲當年、儲藏1，3，2，4年的種子，發芽率，發芽勢，發芽指數和活力指數逐級遞減，儲藏0年的發芽指標均與其他儲藏年份存在顯著差異(P<0.05)。與CK相比，收獲當年種子的發芽指標均得到顯著提高，其發芽指標分別比CK提高了8.9，13.0，9.8和7.3倍。儲藏1年和3年的種子除發芽勢外，其他萌發指標無顯著差異，但儲藏1年時種子發芽勢，發芽指數比CK提高3.4倍和1.1倍(表3)。

表3 草酸引發對不同儲藏年份種子發芽指標的影響Table 3 Effect of oxalic acid initiation on germination indicators of seeds of different storage years

2.3 不同儲藏年份種子幼苗生長對草酸處理的響應

隨著儲藏年份的延長，草酸處理后的幼苗根長呈單峰趨勢變化，儲藏0～2年種子的根長較長，分別較CK提高了37.3%，20.0%和226.0%，其中儲藏2年時的種子幼苗提高效果最好，與其他儲藏年份存在顯著差異(P<0.05)。草酸處理后均能顯著提高幼苗的苗高，較CK相比提高了7～19倍，處理后各苗高之間無顯著差異，說明草酸處理能促進幼苗生長的一致性(圖1)。

圖1 草酸處理對幼苗根長及苗高的影響Fig.1 Effect of oxalic acid treatment on root length and seedling height注：“OA Treament”表示草酸處理Note:“OA Treament” indicates oxalic acid treatment

2.4 不同儲藏年份種子丙二醛含量及抗氧化酶活性對草酸處理的響應

草酸處理后，不同儲藏年限的種子MDA含量隨儲藏年份的延長呈逐漸上升趨勢，收獲當年的種子MDA含量顯著低于其他儲藏年份，與CK相比，儲藏0～2年的MDA含量均有所下降，其中收獲當年的與CK差異最大，較CK降低了35.4%。SOD活性隨儲藏年限的延長呈先上升后下降的趨勢，儲藏1年時的SOD活性可達到最大值2614.3 U·g-1，與其他儲藏年限存在顯著差異；與CK相比，草酸處理提高了不同儲藏年限種子的SOD活性，其中變化最大的是收獲當年的和儲藏1年的種子，SOD活性較CK提高了87.3%，45.5%。草酸處理后，收獲當年的種子POD活性顯著高于其他儲藏年份，比CK降低了18.5%，儲藏3年和4年種子的POD活性比對照升高了5.9倍和1.4倍。草酸處理后，種子CAT活性隨儲藏年份的延長呈逐漸下降趨勢，收獲當年的種子CAT活性與其他儲藏年份差異顯著，并且收獲當年的CAT活性與CK差異最大，較CK提高了1.7倍(圖2)。

2.5 不同儲藏年份種子可溶性糖含量對草酸處理的響應

草酸處理后，種子可溶性糖含量隨儲藏年份逐漸降低，收獲當年和儲藏1年的種子與其他儲藏年限存在顯著差異，最高可達6.5%，儲藏1～3年時種子可溶性糖含量在3.4%～3.7%之間，各儲藏年份之間無顯著差異。與CK相比，草酸處理顯著提高了收獲當年和儲藏1年種子的可溶性糖含量，分別比CK提高了154.1%，91.4%(圖3)。

2.6 種子發芽指標與生理特征相關性分析及主成分分析

草酸處理后種子的POD活性與發芽指標具有極顯著正相關性(P<0.01)，與幼苗的苗高具有顯著正相關性(P<0.05)。CAT活性與發芽率，發芽勢具有極顯著正相關性。除根長外，MDA含量與發芽指標、幼苗生長具有負相關性，其中與發芽勢、發芽指數呈顯著負相關(表4)。

圖2 草酸處理對不同儲藏年份種子丙二醛含量及抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effect of oxalic acid treatment on the MDA,SOD,POD activity and CAT content of S.sphacelata seeds of different storage years

圖3 草酸處理對不同儲藏年份種子可溶性糖含量的影響Fig.3 Effect of oxalic acid treatment on the soluble sugars content of S.sphacelata seeds of different storage years

表4 種子發芽指標與生理生化指標的相關性Table 4 Correlation of seed germination indicators with physiological and biochemical indicators

為了更好的比較外源草酸對不同儲藏年份種子的處理效果，發芽率(X1)、發芽勢(X2)、發芽指數(X3)、活力指數(X4)、根長(X5)、苗高(X6)、SOD(X7)、POD(X8)、CAT(X9)、MDA(X10)和可溶性糖(X11)采用主成分分析法做進一步分析。所檢測的所有指標經標準化處理后，對種子的發芽指標和生理生化指標變化進行主成分方差貢獻率分析(表5)，以特征值>1為提取標準，得到3個主成分的累積貢獻率分別為70.280%，83.351%，95.882%，說明3個主成分能較好的反映正眼數據的信息特征。

表5 主成分方差分析Table 5 PCA of variance

由成分載荷矩陣(表6)可知，發芽率、發芽勢和發芽指數在第1主成分上有較高載荷，說明第1主成分主要反映種子萌發的信息，各指標貢獻率大小順序為發芽勢>發芽指數>發芽率。SOD活性和MDA含量在成分2上載荷較高，且貢獻率大小順序為SOD>MDA，說明第2主成分主要反映種子抗氧化酶活性及脂質過氧化程度的信息。第3主成分根長和苗高的載荷量較高，說明主成分3是反映了幼苗的生長情況，其貢獻率大小順序為根長>苗高。

由表7可知，收獲當年和儲藏1年的種子綜合得分較高，分別為3.25，0.32。5個不同年限的種子主成分分析得分高低順序依次為：0年>1年>2年>3年>4年。

表6 成分載荷矩陣Table 6 Component matrix

表7 草酸處理后不同儲藏年限種子主成分綜合得分及其排序Table 7 Scores and ranking of principal component on S.sphacelate seeds of different storage years after oxalic acid treatment

3 討論

3.1 草酸處理對狗尾草種子萌發的影響

3.2 不同儲藏年份狗尾草種子生理特征對草酸處理的響應

種子在萌發的過程中，為滿足能量所需，種子內部的能量物質在萌發階段水解通過乙醛酸循環、丙酮酸代謝等途徑不斷轉化為小分子有機酸類物質[33]。但種子處在吸水階段時，細胞不斷吸水破裂導致有機酸外滲[34]，導致能量物質不斷降低。不同儲藏年限的‘納羅克’非洲狗尾草種子經外源草酸添加后，萌發指標均有一定程度的升高，收獲當年的種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別是對照組的8.8，13.0，10.0和7.3倍。可能是因為種子木質化程度影響外源物質的滲入，對于收獲當年和儲藏1年的種子，其種殼木質化程度較輕，有利于外源草酸的浸入，彌補種子發芽時有機酸等能量物質的損失。隨著儲藏時間的延長至3年時，種子老化[35]和種殼木質化程度加劇[36]，其致密的種殼致使外源草酸難以進入種子內部，但此時種子的可溶性糖含量也有一定程度的累積，也可為種子萌發時提供能量所需[37]。

隨著儲藏年限的延長，通過草酸處理降低MDA含量的效果逐漸減弱，MDA含量可以表達細胞膜損傷的程度[38]，MDA含量的降低不僅表示植物細胞膜修復的完整性，還能減少植物細胞壁木質化的合成。說明對于儲藏年限短的種子來說，草酸處理可以降低木質素代謝、減少木質化的合成，有利于種子萌發過程中與外界進行水分和氣體交換。本試驗中，儲藏年限較短(0～1年)的休眠種子SOD和CAT活性在25 mmol·L-1草酸處理25 min后都有顯著提高，收獲當年種子的SOD和CAT活性變化最大，分別比對照提高87.3%和164.4%，并且草酸處理后種子的CAT活性與萌發指標呈極顯著正相關(P<0.01)。SOD作為抗氧化系統中的第一道屏障，通過歧化反應將活性氧(ROS)轉化為H2O2，而H2O2在POD，APX和CAT等抗氧化物質的作用下可轉化為H2O 和O2，降低多余H2O2產生的毒害作用[33]。說明外源草酸處理后，種子萌發時產生多余的ROS主要通過SOD和CAT的協同調控對氧化損傷起到防御作用[39]，徐慧敏[40]在研究低分子有機酸對辣椒(Capsicumannum)生長發育及葉片活性氧代謝時也出現類似的結果。25 mmol·L-1的草酸處理提高了儲藏3～4年種子的POD活性，比對照組提高了89.6%和137.2%，表現出隨儲藏年限延長而增加的趨勢，但顯著降低了收獲當年種子的POD活性，這與沈玫等[41]的研究結果類似，草酸處理能夠顯著抑制去殼綠竹筍(Dendrocalamopsisoldhami)的木質素合成關鍵酶PAL，CAD，4-CL和POD的基因表達水平，而這4種酶的活性與其對應基因的表達是協同調控木質素的合成，能提高組織的木質化程度[42]，說明POD活性的升高可能造成木質化程度的加劇，草酸處理通過抑制POD活性基因的表達，在減少POD活性的同時也降低了種子木質化程度。因此，綜合分析評價可見，用25 mmol·L-1，25 min的草酸處理儲藏0～1年狗尾草種子對促進種子萌發與幼苗生長較為適宜。

4 結論

5～25 mmol·L-1草酸處理能顯著提高收獲當年‘納羅克’非洲狗尾草種子的萌發特性，其中收獲當年的種子在草酸濃度25 mmol·L-1，時間25 min時，可以達到破除種子休眠的效果。草酸處理能夠有效清除儲藏年限較短種子的MDA含量，提高種子SOD，CAT活性和可溶性糖含量。但儲藏年限超過1年后，外源草酸處理對種子的萌發效果越差。推薦采用25 mmol·L-1，25 min的草酸處理收獲當年和儲藏1年時的狗尾草種子。