西藏野生垂穗披堿草EnCBL10基因的克隆與功能研究

張慎彤， 高 浩， 張金鵬， 任智慧， 姜惠娜， 其美拉姆， 普布卓瑪， 付娟娟*

(1. 西北農林科技大學草業與草原學院， 陜西 楊凌 712100； 2.西藏自治區拉薩市曲水縣自然資源局， 西藏 拉薩 850000； 3. 西藏自治區農科院草業科學研究所， 西藏 拉薩 85000)

垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)是青藏高原高寒草原和草甸的重要禾本科牧草，是維持高寒地區生態平衡的重要植物之一，是青藏高原地區人工草地的重要飼草，在草地畜牧業中優勢突出，同時也是麥類作物的野生近緣種，具有麥類作物和牧草遺傳多樣性的寶貴基因[1]。廣布于高寒缺氧極端生境條件下的西藏野生垂穗披堿草是研究植物抗逆機理較理想的優質牧草，具有重要的應用價值。

鈣調磷酸酶B類蛋白(Calcineurin B-Like Proteins，CBLs)是鈣信號通路中的重要成員，在植物非生物脅迫應答中具有重要作用。在響應環境脅迫時，CBLs蛋白可以感知細胞中的Ca2+波動，與蛋白激酶CIPKs相互作用，構成植物CBL-CIPK信號通路，調控植物體內Ca2+信號的傳遞并誘導下游的防御響應[2-3]。Kim等[4]研究發現CBL10能夠與CIPK24蛋白在液泡膜互作，將Na+隔離在液泡中，從而解毒鹽脅迫對植物細胞的損傷。最近的研究也表明CBL10缺失會引起植物地上部分對鹽敏感，與cbl4和cbl10單突變體相比，cbl4cbl10雙突變體對鹽更敏感，表明CBL4和CBL10各自調控不同的耐鹽途徑[5]。與之相似，番茄(Solanumlycopersicum)中SlCBL10基因通過調節液泡中的Na+和Ca2+平衡，維持過表達SlCBL10植株中較低的Na+/Ca2+比例，從而提高其耐鹽性[6]。Kang和Nam[7]研究發現CBL10基因能夠正向調控植物的耐鹽性，然而以ABA獨立的方式負向調控植物的水分脅迫抗性。在番茄中的研究也表明SlCBL10基因通過ABA不依賴的方式負向調控植物的耐旱性[5]。我們前期研究發現，鈣信號在西藏當雄野生垂穗披堿草低溫應答中發揮重要作用[8]，其中CBL10是鈣信號通路中的重要基因，但其調控植物低溫等脅迫應答的作用機制尚不明晰。因此，開展西藏野生垂穗披堿草中EnCBL10基因的克隆與功能分析，對深入研究EnCBL10基因調控植物的低溫等非生物脅迫脅迫應答機制具有重要意義。

本研究從西藏野生垂穗披堿草中篩選和克隆了EnCBL10基因，并將其異源表達于煙草中，開展轉基因植株EnCBL10在不同脅迫條件下(干旱、低溫)的生長以及生理響應的研究，揭示EnCBL10基因調控植物低溫和干旱脅迫應答的作用機制，為垂穗披堿草的育種和栽培管理奠定理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2020年9月至2021年6月在西北農林科技大學草地工程實驗室進行。

1.1 材料來源

西藏垂穗披堿草種子采集于西藏拉薩市當雄鎮(30°28.535′N，91°06′246″ E，海拔4 618 m)。亞細胞定位所用本氏煙草(Nicotianabenthamiana)及轉基因所用野生型煙草‘SR1’(N.tabacum‘SR1’)均來自西北農林科技大學草業科學技術實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1提取總RNA及反轉 利用RNA試劑盒提取西藏野生垂穗披堿草葉片中的總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，利用微量分光光度計測定其濃度，采用反轉試劑盒反轉成cDNA。

1.2.2基因的克隆 在NCBI中將西藏野生垂穗披堿草的轉錄組測序獲得的序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP0744 69&go=go)進行同源比對，利用snapgene軟件設計出EnCBL10全長引物EnCBL10-F和EnCBL10-R(表1)，使用諾維贊高保真擴增酶試劑盒(No. P511)進行擴增，PCR程序為95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環；72℃ 5 min，12℃保溫。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物并進行純化，取適量的純化產物連接載體轉化大腸桿菌感受態，挑取單一菌落，PCR檢測為陽性的菌液送生物公司進行測序。

1.2.3生物信息學分析 通過NCBI網站和DNAMAN等軟件分析EnCBL10對應的氨基酸序列的同源性、蛋白的理化性質和蛋白結構域等，使用MEGA 6軟件分析EnCBL10蛋白與其他植物的EnCBL10蛋白的進化關系，構建分子進化樹。通過SignalP4.1 Server網站(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對信號肽進行預測。通過CellPLoc 2.0網站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)預測亞細胞定位。利用ProtParam和ProtScale網站對EnCBL10進行蛋白性質分析，用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進行蛋白二級結構預測。

1.2.4EnCBL10基因表達模式分析 將培養21 d的垂穗披堿草幼苗，分別進行4℃低溫處理0，1.5，3，12，24，120 h，和干旱(保持相對含水量40%)處理0，2，4，6 h，采用LightCycler 480 real-time PCR system分析垂穗披堿草各組織中EnCBL10基因的相對表達水平。利用primer 5軟件設計EnCBL10特異性引物，以EnTublin為內參基因[9-10](表1)，實時熒光定量試劑盒為諾唯贊(Q311)，反應程序為：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。上述試驗共設有4個生物學重復和3個技術重復，以上反應完全結束之后，通過檢測融解曲線來確定PCR產物特異性，采用2-ΔΔCT計算表達量[11]。

表1 各試驗所采用的引物序列表及功能Table 1 List of primers used in different expression and functional analysis of EnCBL10

1.2.5亞細胞定位分析 將已構建好的pCAMBIA1300-EnCBL10-GFP轉化入冰上融化農桿菌感受態EHA105，挑取菌檢陽性的菌液。采用注射法侵染4周齡的本氏煙草葉片，暗培養24～48 h。在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細胞定位。初步確定亞細胞定位后，提取煙草葉片的原生質體，進一步確定EnCBL10的亞細胞定位。

1.2.6轉基因煙草的獲取 構建pARTCAM1300-EnCBL10-GFP過表達載體(用Xho I和Xba I雙酶切質粒pARTCAM1300-GFP)。轉化大腸桿菌，利用基因特異引物進行菌落PCR驗證陽性克隆，送生物公司測序。將測序正確的pARTCAM1300-EnCBL10-GFP重組質粒利用化學轉化法轉化農桿菌感受態EHA105。侵染切下的野生型SR1煙草葉片，侵染5 min，接種于共培養基，暗培養4 d。用滅菌水沖洗3～5遍后，接種于含50 mg·L-1卡那霉素的的篩選培養基中，培養至長出抗性芽。采用EnCBL10特異性引物EnCBL10-F和EnCBL10-R(表1)通過RT-PCR鑒定陽性苗。

1.2.7轉基因煙草的脅迫應答分析 選用已鑒定出的EnCBL10-OX-12和EnCBL10-OX-20兩株系的陽性苗煙草種子消毒后，置于鋪有濕潤濾紙的培養皿中在人工氣候箱萌發，培養條件為光期16 h，光強12 000 lx，溫度為23℃，濕度為80%；暗期8 h，光強0 lx，溫度為20℃，濕度為60%。將培養7 d幼苗，選擇形態均勻健康的幼苗轉移至裝有蛭石的花盆中進行培養。將生長至30 d的幼苗進行低溫和干旱的處理。低溫處理為在低溫培養箱里(4℃)適應處理3 d后，將溫度降至-10℃處理0.5 h，再緩慢恢復到4℃處理直至出現表型；干旱處理采用不澆水處理14 d，恢復處理采用與對照相同的培養方式進行復水。每個處理設置3個生物學重復。分析低溫、干旱脅迫下野生型和EnCBL10轉基因種子的表型差異。采用電導法測定相對電導率[12]。采用李合生的方法[13]分析低溫和干旱脅迫下野生型和過表達植株的抗氧化物酶活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量。

1.2.8數據分析 采用SPSS 25.0軟件進行雙因素方差分析、Duncan’s法對平均值進行比較和Excel軟件進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 基因序列克隆與生信分析

提取西藏當雄野生垂穗披堿草總RNA，以cDNA為模板，CBL10-F和CBL10-R為引物(表1)，通過PCR擴增得到目的片段，將PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序獲得792 bp的序列(圖1A)。

生物信息學分析表明，EnCBL10編碼263個氨基酸，相對分子質量為29 783.96，理論等電點為5.17，屬于疏水性蛋白，無信號肽，含有FRQ1保守結構域。同源比對發現EnCBL10所編碼蛋白質與短芒大麥草(Hordeumbrevisubulatum)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、黍(ChenopodiumalbumL.)、高粱(Sorghumbicolor)和大麥(Hordeumvulgare)的一致性達70%～80%(圖1B)。進化樹結果顯示，EnCBL10蛋白與多個單子葉植物蛋白相似度較高，包括短芒大麥草、大麥的同源性在90%以上(圖1C)。

圖1 EnCBL10基因的序列(A)、同源性比對(B)和進化樹分析(C)Fig.1 Sequence (A),Homology alignment (B) and evolutionary tree analysis (C) of EnCBL10 gene

2.2 EnCBL10基因的表達模式分析

組織表達特異性結果顯示，EnCBL10在垂穗披堿草葉中表達量最高，為根中表達量的56.27倍，為莖中表達量的5.56倍(圖2A)。低溫脅迫處理3 h后EnCBL10基因的表達量達到最高水平，為0 h的1.82倍(P<0.05)；干旱脅迫下，該基因的表達水平在4 h最高，為處理前的4.12倍(P<0.05)(圖2B,2C)。以上結果表明EnCBL10基因參與調控垂穗披堿草的低溫和干旱脅迫應答。

圖2 EnCBL10在西藏野生垂穗披堿草不同組織(A)及在低溫(B)和干旱(C)脅迫下的表達分析Fig.2 Expression of EnCBL10 gene in different tissues (A),and cold(B) and drought(C) stress注:不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)，下同Note:Different small letters are significantly different at the 0.05 level,the same as below

2.3 亞細胞定位

利用CellPLoc 2.0網站分析亞細胞定位，結果顯示西藏野生垂穗披堿草EnCBL10定位于細胞膜和液泡膜。進一步利用構建pCAMBIA1300-EnCBL10-GFP表達載體探究EnCBL10基因編碼的蛋白在細胞中的定位情況。由圖3可知，pCAMBIA1300-EnCBL10-GFP綠色熒光蛋白信號分布在細胞膜中，而pCAMBIA1300-GFP綠色熒光蛋白信號分布在整個細胞，說明EnCBL10編碼蛋白定位于細胞膜上中，這與實驗預測結果大致一致。

圖3 EnCBL10的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of EnCBL10 protein注：標尺為10 μmNote:Scale bar,10 μm

2.4 轉基因陽性苗的鑒定和組織表達特異性分析

經過30 d的篩選培養，共獲得25個煙草抗性苗培養。提取25個抗性苗的總RNA，以反轉錄成的cDNA為模板，以構建過表達載體的引物EnCBL10-F，EnCBL10-R為特異性引物，進行半定量RT-PCR反應，以野生型SR1的cDNA為陰性對照，以煙草的NtUbiquitin基因作為內參基因。RT-PCR檢測結果顯示，野生型SR1中沒有檢測到擴增條帶，有6個株系擴增出與陽性對照大小一致的特異條帶，膠回收、克隆測序表明，所擴增條帶為EnCBL10目的基因序列(圖4A)。初步證明EnCBL10基因已成功在煙草轉錄水平上表達。

EnCBL10在過表達煙草的根、花、老葉和新葉等器官中有不同的表達特征，其中新葉中表達量最高，為根的16.3倍(P<0.05)(圖4B)。

圖4 轉基因陽性苗鑒定(A)和EnCBL10過表達植株(EnCBL10-OX-12)的組織表達分析(B)Fig.4 PCR identification of transgenic positive seedlings (A) and expression of EnCBL10 (EnCBL10-OX-12) in different tissues in transgenic tobacco (B)

2.5 低溫和干旱脅迫對過表煙草和野生型煙草幼苗表型的影響

由圖5A可知，與野生型相比，低溫對異源過表達EnCBL10植株的傷害較小；恢復處理后過表達株系較野生型生長的更好，表明EnCBL10積極地調節植物的抗寒性。干旱脅迫下，野生植株葉片出現明顯的萎蔫，而轉基因株系的葉片脫水較輕，長勢更好(圖5B)，這一結果表明EnCBL10基因能夠提高植物的抗旱性。

圖5 低溫(A)和干旱(B)脅迫對過表達煙草表型的影響Fig.5 Effects in phenotype of overexpressed tobacco under cold (A) and drought (B) stresses注：標尺為5 cmNote:Scale bar,5 cm

2.6 低溫、干旱對過表達轉基因煙草與野生型煙草細胞膜穩定性的影響

低溫和干旱脅迫均能不同程度地增加野生型和過表達EnCBL10植株葉片中的相對電導率，說明低溫和干旱脅迫對這兩個不同基因型的細胞膜均造成了不同程度的損傷(圖6)。低溫脅迫下，野生型植株的相對電導率與對照相比增加259.1%(P<0.05)，而過表達株系EnCBL10-OX-12和EnCBL10-OX-20分別較對照中的過表達株系EnCBL10-OX-12和EnCBL10-OX-20增加了38.5%和69.2%。與對照相比，干旱脅迫導致EnCBL10-OX-12植株中相對電導率增加了123.1%(P<0.05)，EnCBL10-OX-20增加了100.2%(P<0.05)，而野生型中相對電導率較對照增加了181.8%(P<0.05)。

2.7 低溫和干旱脅迫對轉基因煙草葉片中抗氧化酶活性的影響

低溫脅迫下，過表達EnCBL10-OX-12和EnCBL10-OX-20株系葉片中抗氧化酶POD，APX和GR活性與對照下的過表達EnCBL10-OX-12和EnCBL10-OX-20株系相比均呈現增強趨勢，分別較對照增加97.88%，79.5%，265.6%(P<0.05)，和492.5%，81.4%，138.1%(P<0.05)；干旱脅迫下，轉基因株系的POD，APX和GR活性與野生型相比表現出顯著的增強趨勢，過表達EnCBL10-OX-12和EnCBL10-OX-20株系的POD，APX和GR活性分別較對照增加166.9%，400%，146%(P<0.05)和97.8%，351.9%，80.3%(P<0.05)(圖7)。

圖6 低溫和干旱脅迫下過表達煙草葉片相對電導率的變化Fig.6 Changes in relative electrical conductivity in the leaves of transgenic plant under cold and drought stress

圖7 低溫脅迫和干旱脅迫下過表達植株葉片POD(A)，APX(B)和GR(C)活性的變化Fig.7 Changes in the activities of POD (A),APX (B),and GR (C) in the leaves of overexpressed plant under cold and drought stress

2.8 低溫和干旱脅迫對轉基因煙草葉片中可溶性糖、游離脯氨酸含量的影響

低溫脅迫下，野生型煙草葉片中脯氨酸含量與對照相比下降45.4%(P<0.05)，但兩個轉基因株系葉片中的脯氨酸含量與各自對照相比分別提高了79.7%和70.8%(P<0.05)；在干旱脅迫下，野生型和過表達植株中脯氨酸含量均有所降低，但轉基因植株比野生型脯氨酸含量下降幅度小(圖8A)。

過表達和野生型植株中可溶性糖的含量在低溫脅迫下均顯著增加，與對照相比過表達EnCBL10-OX-12和EnCBL10-OX-20株系的可溶性糖含量分別增加281%和956.6%(P<0.05)，且增加幅度超過野生型；干旱脅迫下，EnCBL10-OX-12的可溶性糖含量略有降低，野生型和EnCBL10-OX-20株系的可溶性糖含量均有所增加，但與對照相比差異不顯著(圖8B)。

圖8 低溫干旱脅迫下過表達植株中游離脯氨酸含量(A)和可溶性糖(B)的變化Fig.8 Changes in free proline content (A) and soluble sugar (B) in the leaves of transgenic plant under cold and drought stress

3 討論

植物中主要有三類鈣信使系統，分別為鈣離子-鈣調蛋白(Ca2+-CaM)、鈣離子-鈣調磷酸酶B類似蛋白(Ca2+-CBL)和鈣離子-鈣依賴性蛋白激酶(Ca2+-CDPK)，這些鈣信號參與植物對逆境信號的感知和傳遞[14]。近年來，CBL-CIPK信號在調控植物脅迫應答方面受到國內外學者的普遍關注[15-19]。前期研究發現擬南芥、水稻、玉米和楊樹基因組中含有10個CBL基因家族成員，其中大多數參與脅迫信號傳導途徑[20]，CBLs在接收植物細胞產生的Ca2+信號后，通過激活下游CIPKs的激酶活性實現Ca2+信號的傳遞[16]。許多研究表明植物CBL10基因受多種逆境脅迫誘導表達[15,19]，說明CBL10依賴的鈣信號網絡在植物逆境應答過程中起關鍵作用。然而關于西藏野生垂穗披堿草CBL基因功能的研究未見報道。

本研究從西藏當雄野生垂穗披堿草中克隆了EnCBL10基因，發現該基因能夠被低溫和干旱脅迫誘導表達，表明EnCBL10基因可能參與了上述非生物脅迫應答。為了更深入研究其調控機制，我們進行了組織表達分析、亞細胞定位并構建過表達載體，利用農桿菌侵染法將EnCBL10基因轉入煙草，并對轉基因煙草做了基因的表達量、表型及生理指標等一系列研究。本研究發現EnCBL10基因在西藏野生披堿草根、莖、葉中都有表達，其中葉中表達量最高。這與Egea等[5]在番茄(Solanumlycopersicum)中SlCBL10研究結果類似，該研究指出SlCBL10基因在成熟葉片中表達最高，在根中表達最低，且Slcbl10突變體在鹽脅迫下表現出地上部生長受到抑制，莖頂端壞死。而且在擬南芥Atcbl10突變體中回補SlCBL10能夠提高其脅迫抗性。這表明CBL10主要在植物的地上部組織表達，且在不同物種中其功能可能是保守的[19]。垂穗披堿草EnCBL10蛋白主要定位在液泡膜中，推測在液泡中EnCBL10與特定CIPKs蛋白結合形成復合體激活多種信號通路。相似的研究也指出擬南芥中CBL10定位在液泡中與CIPK24互作，調控其耐鹽性[4]。

在正常生長條件下，植物體內的活性氧代謝處于動態平衡的狀態。但當植物處于低溫、干旱等脅迫環境時，這種代謝平衡被打破，在植物組織中積累了大量活性氧，導致細胞膜結構和功能受到一定損傷，電解質外滲，增加了細胞膜透性[20-23]。電導率是反映植物細胞膜受逆境損傷的重要指標。植物能夠通過激活抗氧化酶活性來抵制活性氧大量積累帶來的氧化傷害[24]。細胞中多種抗氧化酶，如POD，CAT和APX等，在活性氧的清除過程中發揮重要作用[25-28]。本研究發現，過表達EnCBL10植株在低溫和干旱脅迫下相對電導率降低，POD，APX，GR活性均出現不同程度的提高，這說明過表達EnCBL10提高了植物體內抗氧化酶活性，維持了其細胞膜的穩定性，賦予轉基因植株更強的抗逆能力。脯氨酸和可溶性糖作為滲透調節物質，具有較強的水溶性和水合能力，可以促使蛋白質結合更多水分子提升溶解性，有助于維持細胞的滲透平衡，提高植物的抗逆性[29]。低溫脅迫下，過表達EnCBL10導致植物葉片中脯氨酸含量顯著升高，但干旱脅迫下脯氨酸變化較小，這可能是由于干旱時間過長，導致脯氨酸含量下降[30]。已有許多研究表明，鈣信號通過調控抗氧化酶的活性和滲透調節物質來提高植物的低溫等脅迫抗性[31-33]。Zou等[33]研究發現擬南芥CPK8通過磷酸化CAT3增強其蛋白活性，從而調控干旱脅迫下植物體內的H2O2平衡。與之相似，過表達OsCPK24提高了水稻中脯氨酸和谷胱甘肽的含量，可維持更高的GSH/GSSG水平，從而提高水稻的抗寒性[32]。與以上研究結果類似，本試驗發現過表達EnCBL10提高了抗氧化酶活性和脯氨酸的含量，這表明EnCBL10可能與上述鈣信號類似，可能通過調控抗氧化酶活性及滲透調節物質提高植物的抗性，更深層的機制需要進一步挖掘。

4 結論

本研究成功克隆了西藏野生垂穗披堿草EnCBL10基因的CDS序列。EnCBL10基因含有FRQ1保守結構域，與短芒黑麥草、小麥、水稻等相似性較高，該基因在西藏野生披堿草葉中表達量最高。EnCBL10蛋白定位于細胞膜。EnCBL10基因能夠被低溫和干旱等非生物脅迫誘導表達，激活抗氧化防御系統和調節植物體內的滲透平衡來抵御脅迫造成的危害。本研究為進一步挖掘EnCBL10基因調控植物的抗寒、抗旱機制奠定理論基礎。