食管鱗狀細胞癌組織中牙齦卟啉單胞菌感染和負性共刺激因子B7同源體4表達與患者生存的關系

孫 蔚，孫路易，劉怡文，代寧濤，楊海軍，孔金玉，郭藝博，周福有，高社干

(1.河南科技大學第一附屬醫(yī)院分子生物學實驗室，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學第一附屬醫(yī)院河南省微生態(tài)與食管癌防治重點實驗室，河南 洛陽 471003；3.河南科技大學第一附屬醫(yī)院河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室，河南 洛陽 471003；4.安陽市腫瘤醫(yī)院河南省食管癌精準防治醫(yī)學重點實驗室，河南 安陽 455000)

食管癌的發(fā)病率及病死率極高，全世界每年新發(fā)食管癌患者約50萬例，且一半以上發(fā)生在中國[1]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是食管癌中最常見的類型，約占食管癌的95%以上。ESCC患者預后極差，雖然傳統(tǒng)的手術治療、放射治療、化學治療以及靶向治療、免疫治療等手段在腫瘤綜合治療中不斷發(fā)展，但中晚期ESCC患者的5 a生存率仍低于20%[2-3]。ESCC 的病因至今尚不完全明確，其危險因素主要包括吸煙、飲酒、飲食、慢性感染、免疫功能紊亂及遺傳易感性等[4]。

有研究表明，多種病原微生物均可通過長期定植于機體，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[5-7]。清除病原微生物有助于控制腫瘤的惡性進展，但病原微生物感染對腫瘤的作用機制目前尚不完全明確。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)為口腔條件致病菌，機體中其數(shù)量改變可引起微生態(tài)失衡。若口腔頜面部靜脈瓣膜缺如，則Pg可隨血液循環(huán)播散至全身，參與多種疾病進程[8-10]，且與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關[11-14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Pg在ESCC患者癌組織中檢出率顯著高于癌旁組織，且與患者臨床病理學特征及5 a生存期有顯著相關性[12-14]。提示Pg感染和ESCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關，但具體致病機制尚不明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，多種病原微生物均能通過誘導癌細胞負性共刺激因子高表達而逃避免疫監(jiān)視，為自身長期定植提供有利條件，從而促進腫瘤惡性進展[14-16]。負性共刺激因子B7同源體4 (B7 homolog 4,B7H4)是新發(fā)現(xiàn)的共刺激因子家族成員，可協(xié)助腫瘤細胞免疫逃逸，與多種腫瘤惡性進展呈顯著正相關[17-25]。因此，推測Pg可能通過誘導癌細胞中B7H4高表達而促進ESCC惡性進展。基于此，本研究旨在探討ESCC組織中Pg感染和B7H4表達的關系及其對患者生存的影響，以期為ESCC的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2014年1月至2014年12月安陽市腫瘤醫(yī)院收治的ESCC患者為研究對象，并收集手術切除的ESCC組織標本。病例納入標準：(1)經術后病理學檢查確診為ESCC；(2)均行ESCC切除術。排除標準：(1)術前接受過放射治療、化學治療和免疫治療者；(2)病歷資料不完整者。本研究共納入ESCC患者110例，其中男69例，女41例；<60歲49例，≥60歲61例；有吸煙史55例，無吸煙史55例；有飲酒史53例，無飲酒史57例；組織分化程度：低分化22例，中、高分化88例；腫瘤浸潤深度：侵及食管壁外膜75例，未侵及食管壁外膜35例；淋巴結轉移：有淋巴結轉移53例，無淋巴結轉移57例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期63例，Ⅲ、Ⅳ期47例。本研究經安陽市腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器免疫組織化學染色試劑盒(過氧化物酶阻斷劑、山羊血清、山羊抗鼠/兔聚合物及鏈霉菌抗生物素蛋白標記的過氧化物酶)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Pg兔多克隆抗體購自美國路易斯維爾大學口腔醫(yī)學院，B7H4兔多克隆抗體購自美國Abcam公司，檸檬酸抗原修復液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solation，PBS)、吐溫-20 Tris緩沖生理鹽水(Tris-buffered saline and tween-20，TBST)、二氨基聯(lián)苯胺(diamino-benzidine，DAB)顯色劑購自北京索萊寶生物技術有限公司；光學顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 免疫組織化學染色法檢測ESCC組織中Pg感染及B7H4表達情況將110份ESCC組織標本常規(guī)石蠟包埋，切片(厚3～4 μm)；60 ℃溶蠟 1.5 h 后立即放入二甲苯脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇(體積分數(shù)100%、95%、90%、85%)依次水化5 min，流水沖洗1 min；94～98 ℃下檸檬酸鹽緩沖液抗原修復15 min，充分暴露抗原，PBS沖洗；過氧化物酶阻斷劑封閉10 min，PBS沖洗；滴加正常山羊血清室溫避光封閉30 min；取2張連續(xù)切片，分別加入Pg和B7H4兔多克隆抗體(滴度1200)50 μL，4 ℃孵育過夜，次日復溫1 h，PBS沖洗；滴加山羊抗鼠和兔聚合物室溫下孵育30 min，PBS沖洗；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白標記的過氧化物酶室溫下封閉15 min，PBS沖洗，DAB顯色。顯微鏡下觀察顯色適當時，立即用蒸餾水終止顯色；蘇木精復染，梯度乙醇(體積分數(shù)85%、90%、95%、100%)依次脫水1 min，二甲苯透明，風干后中性樹膠封片。

光學顯微鏡下每個樣本隨機挑選5個視野，觀察ESCC組織中Pg感染和B7H4表達情況，以染色強度評分和陽性細胞百分比評分的乘積作為免疫組織化學染色評分結果，以5個高倍鏡視野評分的均值為最終免疫組織化學染色評分。染色強度評分標準：未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。以癌細胞及間質細胞的細胞質出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為Pg感染陽性，以癌細胞的細胞膜出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為B7H4表達陽性。陽性細胞百分比評分標準：陽性細胞百分比≤5%為0分， 5%<陽性細胞百分比≤25%為1分， 25%<陽性細胞百分比≤75%為2分，陽性細胞百分比>75%為3分。Pg陽性判定標準為免疫組織化學染色評分≥2分[13]；B7H4陽性判定標準為免疫組織化學染色評分≥2分[14]。

1.4 隨訪通過電話聯(lián)系進行隨訪，每3個月電話隨訪1次患者及家屬，隨訪時間為確診入院至患者死亡的時間或60個月。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示,2組間生存率比較采用χ2檢驗；2組間生存時間比較采用Log-rank檢驗；采用Cohen′s kappa系數(shù)分析進行Pg感染與B7H4表達一致性檢驗，Kappa>0.7表示一致性顯著，Kappa0.4～0.7表示一致性較好，Kappa<0.4表示一致性較差；采用Kaplan-Meier法分析Pg感染及B7H4陽性表達與ESCC患者預后的關系，患者生存時間為入院時間至最后一次隨訪日期或死亡；采用單因素和多因素Cox回歸分析Pg感染、B7H4表達及臨床病理特征對生存的影響；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ESCC組織中Pg感染和B7H4表達情況結果見圖1。在ESCC組織中，Pg感染主要分布于癌細胞的細胞質，B7H4主要表達于癌細胞的細胞膜。110例ESCC患者癌組織標本中，Pg感染陽性且B7H4表達陽性33例(Pg+B7H4陽性組)，Pg感染和B7H4表達不滿足同時陽性77例(Pg+B7H4陰性組)。

圖1 ESCC組織中Pg感染及B7H4表達(免疫組織化學染色，×400)

2.2 ESCC組織中Pg感染與B7H4陽性表達的一致性結果見表1。Cohen′s Kappa系數(shù)分析結果顯示，ESCC組織中Pg感染與B7H4陽性表達具有顯著一致性(Kappa=0.710，P<0.05)。

表1 ESCC組織中Pg感染與B7H4陽性表達的一致性

2.3 Pg感染及B7H4陽性表達與ESCC患者一般臨床特征的關系結果見表2。ESCC患者Pg感染及B7H4陽性表達與患者性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(P<0.05)，與患者的年齡無顯著相關性(P>0.05)。

表2 Pg感染及B7H4表達與ESCC患者一般臨床特征的相關性

2.4 Pg感染及B7H4表達與ESCC患者預后的關系結果見圖2。Kaplan-Meier分析結果顯示，110例ESCC患者術后5 a生存率為26.36%，中位生存期為(32.000±3.630)個月(95%置信區(qū)間：24.884～39.116)；Pg+B7H4陽性組ESCC患者5 a生存率為12.12%，中位生存期為(19.000±5.742)個月(95%置信區(qū)間：7.746～30.254)；Pg+B7H4陰性組ESCC患者5 a生存率為32.46%，中位生存期為(38.000±5.265)個月(95%置信區(qū)間：27.682～48.318)；Pg+B7H4陽性組ESCC患者5 a生存率及5 a中位生存期顯著低于Pg+B7H4陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.926、9.283，P<0.05)。

A：ESCC患者術后5 a 生存曲線；B:Pg+B7H4陽性組與陰性組ESCC患者術后5 a 生存曲線。

2.5 ESCC患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析結果見表3。110例ESCC患者成功完成術后隨訪，以ESCC組織中Pg感染且B7H4表達陽性、性別、年齡、吸煙 、飲酒、分化程度及腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期為自變量，以ESCC患者5 a生存結局為因變量進行單因素Cox回歸分析，結果顯示，性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期、Pg感染且B7H4表達陽性與ESCC患者生存有關(P<0.05)。

表3 ESCC患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析

2.6 ESCC患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析結果見表4。將單因素Cox回歸分析中差異有統(tǒng)計學意義的因素進一步行多因素Cox回歸分析，結果顯示，腫瘤分化程度、Pg感染且B7H4表達陽性是影響ESCC患者生存的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 ESCC患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

ESCC發(fā)病率及病死率較高，且早期診斷困難，預后極差。因此，尋找精準的早期診斷指標、有效的預防措施及靶向治療方法尤為重要。長期以來，腫瘤相關研究中有關病原微生物慢性感染的探討較少，而實際上，多種病原微生物均可通過重塑宿主免疫微環(huán)境，在腫瘤細胞中長期定植，從而導致腫瘤免疫逃逸并促進其惡性進展[20-25]。Pg作為毒力最強的口腔致病菌之一，其所釋放的內毒素能抑制機體免疫應答，從而有利于其長期定植于機體，促進口腔鱗狀細胞癌、鼻咽癌、ESCC及肺癌等多種腫瘤的惡性進展[11-14]。

病原微生物對腫瘤免疫微環(huán)境的重塑機制至今尚未完全明確，多數(shù)研究認為，病原微生物可通過誘導腫瘤細胞高表達負性共刺激因子，使機體抗腫瘤免疫功能降低甚至喪失[20-25]。幽門螺桿菌、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒及Epstein-Barr 病毒均可通過誘導腫瘤細胞B7H4高表達，協(xié)助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，從而有利于病原體定植于機體[20-25]。腫瘤細胞中B7H4的高表達與腫瘤惡性進展密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，癌細胞高表達B7H4的胰腺癌、胃癌及肺癌患者，其生存率及中位生存時間顯著低于癌細胞低表達B7H4的患者[17-19]；癌細胞高表達B7H4的宮頸癌與肝癌患者的轉移復發(fā)率顯著高于癌細胞低表達B7H4的患者[20-23]；癌細胞高表達B7H4的淋巴瘤患者，癌細胞增殖、侵襲能力顯著高于癌細胞低表達B7H4的患者[24]。

本研究中Cohen′s kappa系數(shù)分析結果顯示，ESCC組織中Pg感染與B7H4陽性表達具有顯著一致性，提示Pg感染可能誘導ESCC細胞高表達B7H4蛋白。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ESCC細胞感染Pg后，隨著感染時間的延長，細胞中B7H4蛋白表達水平呈升高趨勢[14]，與本研究結果一致。

本研究結果顯示，ESCC患者Pg感染及B7H4陽性表達與患者性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期顯著相關，與患者的年齡無顯著相關性；此外，單因素Cox回歸分析結果顯示，性別、吸煙、飲酒及腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期及Pg感染且B7H4表達陽性與ESCC患者生存有關；原因可能為長期吸煙、飲酒易導致口腔環(huán)境惡劣，使Pg更容易感染并定植，并誘導癌細胞高表達B7H4；中、高分化程度(惡性程度高)的ESCC組織及其微環(huán)境更利于Pg生存及高表達B7H4；Pg感染及其對B7H4的誘導效應可能促進了ESCC的惡性進展。

本研究中Kaplan-Meier分析結果顯示，Pg+B7H4陽性組ESCC患者的5 a生存率及5 a中位生存期顯著低于Pg+B7H4陰性組；此外，本研究中多因素Cox回歸分析結果顯示，腫瘤分化程度、Pg感染且B7H4表達陽性是影響ESCC患者生存的獨立危險因素，說明Pg感染且B7H4陽性表達及高分化程度均不利于ESCC患者生存，原因可能為ESCC高分化程度有利于Pg在癌組織中生存，且Pg可通過誘導癌細胞高表達B7H4抑制機體免疫反應，促使癌細胞免疫逃逸，進一步惡化病情，從而縮短患者生存期。

因為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟的演變過程，所以，Pg的具體致病機制有待進一步探討，有效清除Pg并抑制癌細胞B7H4表達可能會延緩ESCC惡性進展并延長ESCC患者的生存期，在ESCC 的臨床治療方面具有重要的理論意義和廣泛的應用前景。

綜上所述， ESCC組織中Pg感染與B7H4陽性表達具有顯著一致性，Pg感染且B7H4表達陽性可促進ESCC的惡性進展且不利于ESCC患者生存。