假木豆提取物對四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護作用

姚 平，周李煜，夏 星，林國彪

(1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院病理科，廣西 南寧 530001;2.廣西中醫藥大學藥理學教研室，廣西 南寧 530001)

肝纖維化是指在各種慢性肝病中，肝細胞發生持續、反復的壞死，導致機體發生修復反應，大量纖維增生，同時伴有纖維降解相對或絕對不足，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肝內大量沉積，超過肝臟自身降解能力所發生的病變。多種因素導致的慢性肝病在發展過程中往往伴隨肝纖維化的發生，活動性肝纖維化如不能得到有效控制，將最終發展為肝硬化，甚至肝癌[1-2]。大部分肝纖維化患者治療后肝纖維化可逆轉至正常[3]。因此，阻斷肝纖維化的發生、發展將成為慢性肝病治療的關鍵環節。目前，臨床上用于治療肝纖維化藥物的療效不十分理想，且藥物價格昂貴、不良反應多。近幾十年來，中醫學對肝纖維化的研究累積了豐富的經驗，應用中藥防治肝纖維化具有費用低、不良反應少、療效好等優勢，具有廣闊的應用前景。

假木豆又名假綠豆、白毛千斤拔、野螞蝗，其味辛、甘，性寒，具有清熱涼血、舒經活絡、健脾利濕之功效，主治咽喉腫痛、內傷吐血、跌打損傷、骨折、風濕骨痛、癱瘓、泄瀉、小兒疳積。假術豆主要分布于福建、廣東、廣西、海南、貴州、云南等地[4]。本課題組前期研究發現，假木豆對肝損傷有保護作用[5]，但假木豆治療肝纖維化的機制尚未見相關報道。水飛薊素是從菊科植物水飛薊中分離提取的一種黃酮類化合物，其在保肝抗炎方面的作用突出，基于此，本研究采用皮下注射四氯化碳(carbon tetrachloride，CC14)的方法制備大鼠肝纖維化模型，以水飛薊素作為陽性對照觀察假木豆水提物對大鼠肝纖維化的保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級Sprague Dawley(SD)大鼠60只，雌雄各半，體質量(200±20)g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK桂2014-0002。

1.2 試劑與儀器水飛薊素膠囊購自德國馬博士大藥廠(進口藥品注冊證號 H20181067)。CC14、無水乙醇購自天津市富宇精細化工有限公司，水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠，白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；電子天平購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，離心機購自上海安亭科學儀器廠，Infinite M200酶標儀購自瑞士Tecan公司。

1.3 藥物提取取假木豆葉(采集自廣西南寧市高峰林場)以水提方式處理(分3次先后用8倍量水、5倍量水、3倍量水提取)，合并提取液，濃縮成浸膏，每毫升相當于生藥材6.22 g。低溫儲存，用時用純水稀釋。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及干預措施取SD大鼠60只，雌雄各半，適應性飼養3 d后，按性別隨機分為空白組、模型組、水飛薊素組、低劑量假木豆組、中劑量假木豆組和高劑量假木豆組，每組10只。水飛薊素組、低劑量假木豆組、中劑量假木豆組、高劑量假木豆組和模型組大鼠參照文獻[6]制備肝纖維化模型，具體方法為：第1周背部皮下注射含體積分數40%CC14的花生油溶液5 mL·kg-1，第2～8周背部皮下注射含體積分數40%CC14的花生油3 mL·kg-1，每隔2 d注射1次。空白組大鼠背部皮下注射花生油，方法同上述各組。第1～8周，以體積分數5%乙醇作為大鼠唯一飲水。從第3周起，水飛薊素組大鼠每日灌服水飛薊素膠囊水溶液(50 mg·kg-1)1次；低、中、高劑量假木豆組大鼠每日灌服12.5、25.0、50.0 g·L-1的假木豆水提液(20 mL·kg-1)；空白組和模型組大鼠灌服等體積的蒸餾水；各組大鼠均連續給藥6周。

1.4.2 各組大鼠一般狀況觀察實驗期間觀察并記錄各組大鼠飲食活動情況、體質量、毛色光亮程度、精神狀況等一般情況。

1.4.3 ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平末次給藥1 h后，各組大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)進行麻醉，采集大鼠腹主動脈血5 mL，室溫下靜置 2 h，3 000 r·min-1離心10 min，收集血清，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.4 各組大鼠肝臟大體形態及病理組織學形態觀察采血后處死大鼠，取肝臟觀察大體形態；然后取大鼠肝臟左葉，于體積分數10%甲醛溶液中固定24 h 以上，然后制備肝組織切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，光學顯微鏡下觀察并拍照，觀察大鼠肝臟病理形態學變化。

2 結果

2.1 6組大鼠一般情況比較空白組大鼠飲食正常，活動頻繁，毛色潔白有光澤，精神狀況正常。模型組大鼠飲食減少，活動量明顯減少，毛色暗淡、不清潔，精神狀況萎靡；水飛薊素組大鼠飲食正常，活動正常，毛色欠缺光澤但較清潔，精神狀況較好；各劑量假木豆組大鼠飲食略有減少，活動量一般，皮毛較暗淡，略發黃，精神狀況尚可，總體情況較模型組佳而比空白組差。 模型組、水飛薊素組、低劑量假木豆組、中劑量假木豆組、高劑量假木豆組大鼠體質量增長量少于空白組，差異有統計學意義(P<0.05);低劑量假木豆組大鼠體質量增長少于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 6組大鼠體質量增長量比較

2.2 6組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較結果見表2。模型組、水飛薊素組、低劑量假木豆組、中劑量假木豆組、高劑量假木豆組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)；水飛薊素組與空白組大鼠血清中TGF-β1水平比較差異無統計學意義(P>0.05);模型組、低劑量假木豆組、中劑量假木豆組、高劑量假木豆組大鼠血清中TGF-β1水平均高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。水飛薊素組、低劑量假木豆組、中劑量假木豆組、高劑量假木豆組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平均低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。低劑量假木豆組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平顯著高于水飛薊素組，差異有統計學意義(P<0.05)。 中劑量假木豆組與水飛薊素組大鼠血清中IL-1β、IL-6水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，中劑量假木豆組大鼠血清中TNF-α、TGF-β1水平顯著高于水飛薊素組，差異有統計學意義(P<0.05)；高劑量假木豆組與水飛薊素組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。低、中、高劑量假木豆組大鼠血清中IL-1β水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。高劑量假木豆組大鼠血清中IL-6、TGF-β1水平顯著低于低劑量假木豆組，差異有統計學意義(P<0.05)；中劑量假木豆組與低劑量假木豆組、高劑量假木豆組與中劑量假木豆組大鼠血清中IL-6、TGF-β1水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。低、中、高劑量假木豆組大鼠血清中TNF-α水平兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 6組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平比較

2.3 各組大鼠肝臟大體形態空白組大鼠肝臟顏色鮮紅，形狀楔形，肝臟邊緣整齊，表面光滑平整。模型組大鼠肝臟顏色晦暗，肝臟表面布有密集的小孔，凹凸不平，有較為嚴重的腫大或萎縮。水飛薊素組及各劑量假木豆組大鼠肝臟顏色較為暗淡，表面稍粗糙、布有較多小孔，肝臟變形情況較模型組輕。

2.4 各組大鼠肝組織病理學形態結果見圖1。空白組大鼠肝組織結構完整，肝小葉結構正常，未見有肝細胞水腫及脂肪變。模型組大鼠肝組織肝纖維化明顯，可見嚴重的肝細胞水腫、脂肪變性以及明顯的假小葉形成。水飛薊素組大鼠肝組織可見較為嚴重的肝細胞水腫、脂肪變性，未見纖維化，也未見假小葉形成。低劑量假木豆組大鼠肝組織可見嚴重肝細胞水腫和脂肪變性，肝組織中可見較薄的纖維結締組織增生，部分分隔肝小葉，有少量假小葉形成。中劑量假木豆組大鼠肝組織中可見嚴重肝細胞水腫、脂肪變性，有少量肝纖維形成，未見假小葉形成。高劑量假木豆組大鼠肝組織中可見較為嚴重的肝細胞水腫及脂肪變性，肝纖維化情況輕微，未見有假小葉形成。水飛薊素組和假木豆中、高劑量組大鼠肝組織病理學形態較模型組有較大的改善，肝纖維形成減輕或消失，沒有假小葉形成；低劑量假木豆組大鼠肝組織病理學形態較模型組有輕微改善但不明顯。各組大鼠肝細胞水腫、脂肪變性均未得到明顯改善。

A:空白組;B:模型組;C:水飛薊素組；D：高劑量假木豆組；E：中劑量假木豆組；F：低劑量假木豆組。

3 討論

肝纖維化是由多種原因引起的慢性肝損害所致的病理改變，是多種慢性肝病共有的病理變化。肝纖維化是一個動態發展過程，隨著纖維化程度的加深，可發展為肝硬化，甚至肝癌。肝纖維化是一種損傷愈合反應，其發生是肝臟中ECM增生和降解失衡，造成肝臟內纖維結締組織異常沉積、肝臟結構和功能改變的結果[7-8]。有研究認為，肝纖維化是一個可逆的過程，阻斷肝纖維化是一個有前景的針對肝臟相關疾病的治療手段[9]。目前臨床上尚無有效治療肝纖維化的藥物，故開發治療肝纖維化的藥物仍是新藥研發的熱點[1]，而中藥因其低毒性及全局性效果受到廣泛關注[10-12]。

IL屬于細胞因子家族，是重要的炎癥介質和免疫調節因子，可以調節肝臟炎癥及免疫功能，從而影響肝纖維化的發生、發展。IL-1β、IL-6、IL-8具有明確的促肝纖維化作用，IL-2、IL-10具有抗肝纖維化作用。肝纖維化發生時，肝臟細胞中IL-1β的表達增加，IL-1β可刺激肝臟發生炎癥反應，進一步促進肝纖維化的發展[13-14]。IL-6參與肝纖維化的多種病理過程，被認為是肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化的標志[15-16]。TNF是一種與內毒素無關的、可引起腫瘤出血壞死的活性分子[17]。正常情況下，肝組織中不表達或微量表達TNF-α，當受到損傷因素刺激時，大量的TNF-α被釋放出來，參與肝損傷過程，促進肝纖維化的發生、發展[18-19]。有研究顯示，血清中TNF-α水平隨患者肝纖維化程度的加重而升高，且與血清中的某些肝纖維化因子水平呈正相關[20]，說明TNF-α不僅介導炎癥反應，還參與了肝纖維化的形成過程，與肝纖維化密切相關。TGF-β1是細胞因子TGF-β超家族的成員，對細胞的生長、分化和多種生理、病理過程起重要調節作用，在肝纖維化的發生、發展過程中起著關鍵作用[21]。其通過活化HSC、促進ECM的合成與沉積而致肝纖維化，是肝纖維化重要的始動因子之一。 本研究結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1水平顯著升高，且病理組織學顯示模型組大鼠肝臟損傷嚴重，有明顯的纖維化特征，說明 CCl4誘導的肝纖維化模型制備成功。本研究發現，與模型組比較，假木豆高、中劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1水平顯著降低；低劑量假木豆組大鼠血清中IL-6、TNF-α和TGF-β1水平顯著降低，IL-1β水平無明顯變化。該結果提示假木豆提取物對大鼠肝纖維化有保護作用，其作用機制可能與降低血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及TGF-β1水平有關。高劑量假木豆組與水飛薊素組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1比較差異無統計學意義，說明高劑量假木豆對肝纖維化大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的作用與水飛薊素相當。不同劑量假木豆組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及TGF-β1水平隨假木豆水提物劑量的升高呈下降趨勢，但只有血清中TNF-α水平在3個劑量組之間比較差異有統計學意義，而血清中IL-1β水平在3個劑量組之間比較差異無統計學意義。因此，假木豆提取物與上述各指標的量效關系需進一步研究來驗證。

綜上所述，假木豆提取物具有抗肝纖維化作用，其作用機制可能與降低血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及TGF-β1水平有關。