乳巖寧方聯合依西美坦對MCF-7 乳腺癌細胞周期及ERα、p-Akt 表達的影響*

周躍華，高 宏，殷東風

遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽110032

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一［1］。乳腺癌的治療方法主要有手術治療、放化療、內分泌治療、分子靶向治療等。對于激素受體陽性的乳腺癌患者，內分泌治療為其重要手段，可延長患者無病生存期（disease free survival，DFS）及總生存期（overall survival，OS），降低復發轉移風險。對于絕經后乳腺癌指南推薦芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor，AI）療效優于他莫昔芬（tamoxifen，TAM），對于絕經前乳腺癌患者合并高危因素，推薦卵巢去勢（ovarianfunction suppression，OFS）聯合AI 治療，奠定了AI 內分泌治療的地位。HIGGINS MJ［2］研究證實將AI 術后輔助治療延長至10年，可降低乳腺癌復發風險。依西美坦為一種不可逆性甾體芳香酶滅活劑，是常用的AI類藥物。但是內分泌治療帶來的副作用如類更年期綜合征癥狀、骨質疏松、血脂異常、關節痛等嚴重影響患者生活質量，甚至導致放棄內分泌治療。而中藥乳巖寧從“調暢氣機”［3］入手，能改善內分泌治療的副作用［4］及治療依從性，延長OS［5］。本研究探討中藥復方乳巖寧聯合依西美坦對MCF-7(michigan cancer foundation-7，MCF-7)乳腺癌細胞周期及ERα（estrogen receptor α，ERα）、p-Akt(phosphorylated-protein kinase B，p-Akt)蛋白表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株雌激素受體(estrogen receptor，ER）陽性人乳腺癌細胞株MCF-7 購自中科院上海細胞生物學研究所。

1.2 實驗動物SPF級雌性BALB/C裸鼠43只，5～6周齡，體質量（20±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物實驗合格證號：SCXK（滬）2007-0005。

1.3 實驗藥品及制備乳巖寧的制備：乳巖寧方由柴胡10 g，法半夏10 g，人參15 g，浙貝母15 g，黃芩15 g，炙甘草10 g，生龍骨30 g，生牡蠣30 g，白花蛇舌草15 g，薏苡仁15 g，半枝蓮15 g，莪術15 g等14味中藥組成，購于遼寧中醫藥大學附屬醫院，水煎濃縮至生藥濃度為3.3 g/mL 溶液，無菌實驗陰性，4 ℃冰箱保存備用。依西美坦片（阿諾新，輝瑞制藥，批號：H20120399，規格：25 mg/片）將25 mg 依西美坦片加入62.5 mL 蒸餾水中充分溶解，調節生藥濃度至0.4 mg/mL備用。

1.4 主要試劑與儀器細胞周期及細胞凋亡檢測試劑盒（PI，碧云天生物，貨號：C1062）；兔抗ERα多克隆抗體（北京博奧森生物，批號：909086W）；兔抗p-Akt多克隆抗體（北京中杉金橋，貨號：ZA-0105）；OLYMPUS BX41 型數碼顯微鏡（日本OLYMPUS）；FACS CaliburTM 型流式細胞儀（美國BD 公司）；DYY-6C 電泳儀、DYYm40B 型水浴式轉印電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗動物飼養 實驗動物飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物室，動物實驗許可證號：SYXK（遼）2013-0009，專人飼養。

1.5.2 去勢裸鼠模型制備 采用10%水合氯醛按4 mL/kg 腹腔注射麻醉后將裸鼠四肢固定，俯臥于手術臺，背部碘伏消毒，切開皮膚，于脊柱旁開0.5 cm，距肋弓下緣0.5 cm 處切開皮膚、肌肉，剪開腹膜進入腹腔，可見乳白色組織，輕輕提出，即可見粉紅色“桑椹樣”卵巢，分離后鉗夾、結扎，剪去卵巢，檢查無滲血后分層縫合皮膚。同樣方法切除對側卵巢，保溫20 ℃左右待麻醉蘇醒。術后肌肉注射青霉素抗炎，碘伏切口消毒，每日1次，連續3天。

1.5.3 荷瘤裸鼠動物造模 將呈對數生長期的MCF-7 乳腺癌細胞配置成細胞懸液，調整濃度為1×107/mL，取0.2 mL在切除卵巢裸鼠的右腋窩脂肪墊下接種，注射完畢后夾閉針孔片刻，共接種3只，接種后10天左右接種部位處出現白色腫瘤結節，質地較硬，逐漸增大，越長越快。當原代腫瘤長至0.8 cm3大小時手術取下腫瘤，使用骨髓穿刺針原位移植至剩余40只裸小鼠乳墊下，接種后飼養于SPF 級動物實驗室，移植第4～5 天后乳墊處即可見腫瘤生長，成瘤率100%，形狀、大小較整齊［6］。

1.5.4 動物分組及給藥 將40 只造模成功的絕經后荷瘤裸鼠隨機分為4 組各10 只，根據人和鼠給藥劑量換算公式［7］計算各組給藥劑量。模型組：生理鹽水每日0.2 mL 灌胃；依西美坦組：依西美坦按4 mg/kg（體質量）給藥（相當于臨床人用量的10倍），每日0.2 mL 灌胃；乳巖寧組：乳巖寧按33.3 g/kg（體質量）給藥（相當于臨床人用量的12倍），每日0.2 mL灌胃；結合組（乳巖寧+依西美坦），乳巖寧33.3 g/kg（體質量）+依西美坦4 mg/kg（體質量）每日0.2 mL，連續給藥21天。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 流式細胞儀檢測乳腺癌細胞周期 將瘤組織用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm 小塊，越小越好，0.25%胰酶消化，400 目篩網過濾細胞，收集單細胞懸液，碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染法37 ℃避光染色30 min，流式細胞儀上樣檢測細胞周期，激發波長488 nm，同時采用Multicycle DNA content and cell cycle analysis軟件對測量值進行細胞DNA含量分析。

1.6.2 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測瘤組織中ERα、p-Akt 蛋白表達 -20 ℃冰箱中取出腫瘤組織，取標本100 mg，加入500 μL 冰預冷的細胞裂解液，組織勻漿，采用酚試劑法測定蛋白質含量。根據所測蛋白分子量選擇相應濃度的SDS聚丙烯酰胺凝膠，灌制12%分離膠與4%濃縮膠，凝膠后上樣，電泳，轉膜，標記目的條帶，封閉，加入特異性一抗，4 ℃雜交過夜；洗液洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，作用1 h，洗滌，堿性磷酸酶法顯色，暗室曝光、顯影、定影、掃描照相，用Scion Image 軟件對蛋白電泳帶進行灰度值檢測，定量分析。

1.7 統計學方法采用SPSS 20.0 軟件分析數據，計量資料以表示，采用單因素方差分（ANOVA），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般狀態用藥第3、5、9 天，結合組、模型組及依西美坦組分別有1 只荷瘤裸鼠出現頭部偏向一側類“中風偏癱”癥狀而剔除實驗，其余荷瘤裸鼠狀態良好，正常自由活動、進食，給藥10天后依西美坦組與結合組荷瘤裸鼠皮膚色澤晦暗，進食量減少，精神萎靡，喜蜷臥，依西美坦組最明顯；給藥第18 天結合組1 只裸鼠因腫瘤消耗死亡，死亡極度消瘦，體質量15 g。乳巖寧組荷瘤裸鼠狀態較好，直至實驗結束無死亡。

2.2 乳腺癌細胞周期各用藥組G0/G1期細胞比例增多，S 期比例減少，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。結合組G0/G1期細胞比例最多，S 期細胞比例最少，與依西美坦組及乳巖寧組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。乳巖寧組與依西美坦組比較，G0/G1期、S 期細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1及圖1—4。

表1 各組裸鼠移植瘤細胞周期分布情況（）%

表1 各組裸鼠移植瘤細胞周期分布情況（）%

注：☆表示與模型組比較，P＜0.01；★表示與結合組比較，P＜0.01；◆表示與乳巖寧組比較，P＞0.05

圖1 模型組乳腺癌細胞周期

圖2 依西美坦組乳腺癌細胞周期

圖3 乳巖寧組乳腺癌細胞周期

圖4 結合組乳腺癌細胞周期

2.3 瘤組織中ERα、p-Akt 蛋白表達模型組中ERα 及p-Akt 蛋白低表達，與3 個用藥組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；各用藥組均可下調ERα及p-Akt 蛋白表達，其中結合組作用更顯著，與乳巖寧組、依西美坦組相比較差異有統計學意義（P＜0.01），乳巖寧組與依西美坦組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5、表2。

表2 各組乳腺癌組織ERα、p-Akt蛋白表達灰度值（）

表2 各組乳腺癌組織ERα、p-Akt蛋白表達灰度值（）

注：☆表示與模型組比較，P＜0.01；★表示與結合組比較，P＜0.01；◆表示與乳巖寧組比較，P＞0.05

圖5 各組乳腺癌組織ERα、p-Akt蛋白表達電泳圖

3 討論

細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞的增殖、凋亡和衰老均依賴于細胞周期的調控。細胞周期調控機制的失活，特別是G1/S 期和G2/M期，在惡性腫瘤發生、發展過程中起至關重要的作用［8］。細胞周期主要有G0/G1期-DNA 合成前期、S期-DNA 合成期、G2/M 期-DNA 合成后期及分裂期。Akt 作為PI3K/Akt 信號通路的下游分子，磷酸化后的AKT 具有多種生物學活性，可促進腫瘤細胞的增殖，促進侵襲和轉移，調控腫瘤血管形成，抑制凋亡，產生耐藥等［9］。陳子涵等［10］研究表明蒲公英根水提物可通過抑制Akt 活化，激活細胞線粒體凋亡途徑，使凋亡相關蛋白（Caspase-9）表達增加，從而促進人乳腺癌細胞株MDA-MB-231（Human breast cancer cell line，MDA-MB-231）細胞的凋亡。

乳腺癌為激素依賴型腫瘤，乳腺癌的發生發展與雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇）關系密切［11］。而雌激素主要與ER 結合后作用于靶組織發揮作用，我們通常認為，ER 陽性患者預后優于ER 陰性患者，雌激素受體的情況是判斷預后的指標。同時ER 表達狀況可作為乳腺癌化療敏感程度的一個指標。匡忠生等［12］研究新輔助化療方案敏感性與ER、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及人類表皮生長因子受體2(Human epithelial growth factor receptor 2，HER-2）表達情況，發現ER、PR 陰性或弱表達乳腺癌對CAF(環磷酰胺CTX+阿霉素ADM+氟尿嘧啶5-FU)、CAT(環磷酰胺CTX+阿霉素ADM+多西他賽TXT）方案更敏感。ERα與PI3K/Akt 信號轉導通路關系密切，Martin 等研究證實活化的Akt使ERα 中AF-1 區的絲氨酸殘基發生磷酸化，從而實現表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1）對ERα的調節［13］。PI3K/Akt 信號通路也可能磷酸化ER，誘導ER 靶點的雌激素非依賴性激活和表達，導致內分泌治療耐藥［14］。本實驗發現中藥復方乳巖寧聯合依西美坦可使p-Akt 及ERα蛋白表達水平下降，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），結合組作用更顯著，與乳巖寧組、依西美坦組比較差異有統計學意義（P＜0.01），說明乳巖寧聯合依西美坦可能是通過下調癌組織中p-Akt、ERα蛋白表達抑制PI3K-Akt 信號通路的活性來抑制MCF-7乳腺癌增殖，也說明ERα與p-Akt 有密切聯系。與前期實驗研究結果一致，中藥乳巖寧聯合TAM可以使ERα蛋白表達減少，從而抑制乳腺癌生長［15］。

中醫認為乳腺癌的病因病機與抑郁、憂思惱怒等情志因素及沖任失調有關。馮兆張《馮氏錦囊秘錄》中曰：“婦人有憂怒抑郁，朝夕積累，脾氣消阻，肝氣橫逆，氣血虧損，筋失營養，郁滯與痰結成隱核……積之漸大，數年而發，內潰深爛，名曰乳巖。”乳巖寧方是我科協定處方，從肝入手，將調暢氣機理論應用于乳腺癌治療，從《金匱要略》柴胡加龍骨牡蠣湯加減化裁而來。關于乳巖寧方我們進行了大量實驗研究［15-19］。本研究結果顯示，各干預措施能延緩MCF-7 乳腺癌細胞的周期進程，結合組效果最明顯。乳巖寧組與依西美坦組比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明中藥乳巖寧與依西美坦合用有協同抗腫瘤的作用。

綜上所述，乳巖寧聯合依西美坦抑制乳腺癌細胞增殖可能通過改變組織細胞周期進程，下調癌組織中ERα、p-Akt 蛋白表達來抑制PI3K-Akt信號通路的活性來實現，同時乳巖寧與依西美坦有協同作用。本研究未對ERα進行分型研究，今后需對PI3K-Akt下游基因進行深入研究。