基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索青黛治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制*

甘麗華，楊 坤，李志敏，何 泉，郭超峰

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性消化道炎癥疾病，目前病因尚未明確，被世界各國(guó)衛(wèi)生組織列為疑難性疾病之一［1］，以結(jié)直腸黏膜屏障破壞，腸道菌群紊亂，彌漫性炎癥改變?yōu)樘攸c(diǎn)。患者常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重及黏液膿血便等特點(diǎn)。西醫(yī)認(rèn)為UC多與免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)有關(guān)，采用氨基水楊酸類(lèi)、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療［2-3］，但需長(zhǎng)期使用，易對(duì)藥物產(chǎn)生依賴(lài)性，不耐受，繼發(fā)新的感染，達(dá)不到理想治療效果。UC 屬中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“痢疾”“腸辟”等范疇，主要病機(jī)為濕熱蘊(yùn)結(jié)腸道，氣血不調(diào)［4］，治療以化濕為主，輔以清熱解毒或健脾等法。

據(jù)2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》記載青黛是蓼科植物蓼藍(lán)，爵床科植物馬藍(lán)和十字花科植物菘藍(lán)的莖或葉加工后的干燥粉末或顆粒，具有清熱解毒、涼血消斑等功效［5］。《本經(jīng)逢源》中記載青黛具有“散郁火，治溫毒發(fā)斑及產(chǎn)后熱痢下重”的功效。陳銘詩(shī)［6］采用復(fù)方青黛顆粒聯(lián)合美常安治療UC，可降低患者疾病活動(dòng)指數(shù)，增加T淋巴細(xì)胞水平，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，保護(hù)腸黏膜屏障。馬文強(qiáng)等［7］研究青黛在UC 模型小鼠的體內(nèi)作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)青黛能有效抑制小鼠體內(nèi)炎癥因子和細(xì)胞凋亡因子釋放，提高抗凋亡因子水平，阻斷炎癥形成。日本單中心研究發(fā)現(xiàn)，患者口服青黛治療UC后出現(xiàn)肝損傷，惡心頭痛，感染性結(jié)腸炎等不良反應(yīng)但停藥后可逆［8］。

目前青黛基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究尚少［9］。現(xiàn)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討青黛治療UC的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)軟件中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot（https：//www.uniprot.org/）、人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、R 語(yǔ)言分析軟件R3.6.1（https：//www.r-project.org/）、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治鲕浖﨏ytoscape 3.7.2（http：//cytoscape.org/）、蛋白質(zhì)互作平臺(tái)String（https：//www.string-db，org/）、生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)David 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）及函數(shù)繪圖軟件Origin 9（https：//www.originlab.com/）。

1.2 青黛活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中以“青黛”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取其拉丁名，檢索青黛化合物信息，根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和藥物相似性（druglikeness，DL）＞0.18兩個(gè)生物活性指標(biāo)篩選出符合條件的有效成分。并在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)Related Targets 中檢索青黛全部活性靶點(diǎn)，篩選出與上述有效成分相關(guān)的靶點(diǎn)，將這些靶點(diǎn)蛋白名稱(chēng)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)，將靶點(diǎn)蛋白全稱(chēng)轉(zhuǎn)換成相對(duì)應(yīng)靶基因簡(jiǎn)稱(chēng)，整合靶基因，刪除數(shù)據(jù)庫(kù)不存在的基因，最終得到青黛有效成分靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)以UC 的英文名“ulcerative colitis”為檢索關(guān)鍵詞在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)中找出UC的相關(guān)基因。

1.4 藥物對(duì)疾病潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖在R 軟件中找出青黛活性成分的靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)基因兩者的交集并繪制出Venn 圖，初步預(yù)測(cè)青黛治療UC 潛在作用靶點(diǎn)。再將藥物有效成分及作用靶點(diǎn)和疾病的相關(guān)基因等導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，得出藥物-成分-疾病-靶基因思維關(guān)系圖并將其關(guān)系進(jìn)行可視化。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建運(yùn)用String 軟件將藥物靶點(diǎn)與疾病基因相交集的蛋白基因進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建，并找出核心基因。

1.6 基因本體論及基因和基因組的京都百科全書(shū)分析將“青黛”有效作用于疾病的靶點(diǎn)上傳至David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，以Homo spapiens為研究對(duì)象，選 擇Gene-Ontology（3 selected）和Pathways（3 selected）條目，設(shè)置P值（P＜0.01），進(jìn)行基因本體論功能富集（gene ontology，GO）分類(lèi)分析了解靶點(diǎn)的主要作用過(guò)程以及KEGG 富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，觀察靶點(diǎn)在通路中的分布情況。將結(jié)果導(dǎo)入Origin 9 畫(huà)圖軟件中繪制出相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路圖。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分以“青黛”為關(guān)鍵詞從TCMSP共檢索出29個(gè)活性化合物，以O(shè)B＞30%，DL＞0.18為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出9個(gè)活性有效成分及其參數(shù)信息。其中靛藍(lán)二聚體和靛甙沒(méi)有有效靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)。見(jiàn)表1。

表1 青黛有效活性成分基本信息

2.2 青黛調(diào)控UC網(wǎng)絡(luò)圖利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCMSP 獲得的100 個(gè)靶蛋白全稱(chēng)進(jìn)行簡(jiǎn)稱(chēng)轉(zhuǎn)換后獲 得48 個(gè)靶基因，結(jié)合Gene Cards 找出UC 的4209個(gè)相關(guān)基因，兩者取交集后共得到31個(gè)共同靶基因。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建中藥化合物-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)共有38個(gè)節(jié)點(diǎn)（7 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，31 個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)），疾病1個(gè)，31個(gè)共同靶基因，邊85條，有對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的化合物7 個(gè)（分別為靛玉紅、靛藍(lán)、異靛藍(lán)、異牡荊素、β-谷甾醇、吲哚類(lèi)及喹啉類(lèi)化合物）其中靛玉紅和β-谷甾醇作用靶點(diǎn)最多，分別為17個(gè)和12個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-靶點(diǎn)-疾病-基因網(wǎng)絡(luò)

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)在STRING 數(shù)據(jù)平臺(tái)上輸入31個(gè)共同靶點(diǎn)，導(dǎo)出PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，圖中含有30 個(gè)靶蛋白和150 組互作邊，其中PRSS1 是游離蛋白，故將其刪除。其中節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白，兩蛋白之間用邊相連，邊的度值由藍(lán)色變黃色逐漸變小，邊越粗表示核心地位越大。其中排名前5 的蛋白分子為JUN（轉(zhuǎn)錄因子AP-1）、CASP3（半胱天冬酶3）、CASP8（半胱天冬酶8），PTGS2（人前列腺素G/H合成酶2）、RELA（轉(zhuǎn)錄因子p65）。度值越大的蛋白質(zhì)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，同時(shí)也是青黛治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2—3。

圖2 青黛治療UC相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 青黛治療UC關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4 GO 富集分析GO 富集分類(lèi)分析獲得條目共84 條，其中生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）和分子功能（MF）條目分別為66、5、13 條。生物過(guò)程主要包括細(xì)胞對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)等；細(xì)胞組成主要包括胞質(zhì)、高爾基體、核等；分子功能主要包括血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、sequence-specific DNA結(jié)合等。將前10位生物過(guò)程結(jié)果導(dǎo)入Origin 9畫(huà)圖軟件，根據(jù)P值（P＜0.01）和基因富集數(shù)目的多少繪圖，見(jiàn)圖4。

圖4 青黛治療UC的GO富集分析BP圖（前10位）

2.5 KEGG 通路分析KEGG通路富集分析得到93條通路（P＜0.01）。其中與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答相關(guān)的信號(hào)通路有白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路、Toll 樣受體(Toll like receptor，TLRs)信號(hào)通路等，體現(xiàn)青黛治療UC 的多通路特點(diǎn)，部分通路見(jiàn)表2和圖5。

圖5 青黛治療UC的KEGG通路分析氣泡圖

表2 青黛治療UC的KEGG通路分析

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，青黛具有類(lèi)皮質(zhì)激素樣作用，能抑制平滑肌，降低毛細(xì)血管通透性，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，具有抗菌，抗病毒和抗腫瘤作用［12］，主要治療UC、銀屑病和白血病3 類(lèi)疾病［13］。本研究發(fā)現(xiàn)青黛包含多種有效成分，可作用于UC多個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)及代謝通路，有減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)腸黏膜作用。

3.1 有效成分與靶點(diǎn)蛋白經(jīng)檢索TCMSP 和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖分析結(jié)果顯示，青黛有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的前5 個(gè)活性成分是靛玉紅、β-谷甾醇、異牡荊素、氧代吲哚啉類(lèi)及靛藍(lán)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)分別為17、12、5、5、4 個(gè)，體現(xiàn)青黛治療UC 多成分和多靶點(diǎn)特性。劉麗娟等［14］研究發(fā)現(xiàn)靛藍(lán)可下調(diào)體內(nèi)IL-6 水平，發(fā)揮對(duì)UC 的體外抗炎作用。李楠等［15］研究靛玉紅對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC 大鼠的作用機(jī)制，結(jié)果顯示靛玉紅可提高結(jié)腸中ITF mRNA 表達(dá)，降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)水平，達(dá)到抑制UC 炎癥的效果。DING KANG 等［16］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇能增加小鼠腸上皮細(xì)胞抗菌肽的表達(dá)，減少鼠型傷寒沙門(mén)氏菌的生存，減少白細(xì)胞和凋亡因子的浸潤(rùn)，保護(hù)腸道屏障功能［17］。經(jīng)PPI關(guān)鍵靶點(diǎn)分析，青黛作用于UC 的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能是JUN、CASP3、PTGS2、CASP8、RELA 等。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，JUN 是AP-1（由c-Jun 和c-Fos 構(gòu)成）單位之一，AP-1是位于JNK下游的關(guān)鍵信號(hào)蛋白分子，而AP-1 高頻出現(xiàn)在炎癥信號(hào)通路上，JNK 通路受上游刺激后，被磷酸化激活，進(jìn)而激活JUN，使炎癥啟動(dòng)并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄［18］，此外c-Jun 的高表達(dá)可能參與UC 的發(fā)展［19］。CASP 家族以無(wú)活性酶原存在于細(xì)胞質(zhì)中，接受各種細(xì)胞凋亡的信號(hào)后激活CASP 系列蛋白分子，使其裂解細(xì)胞生存的蛋白，參與細(xì)胞凋亡和組織損傷過(guò)程［20］，CASP3 與UC 上皮細(xì)胞凋亡關(guān)系密切［21］。PTGS2 也稱(chēng)為COX-2，是一種合成前列腺素和炎癥反應(yīng)的有效酶，參與人體炎癥反應(yīng)，是治療UC 的重要靶點(diǎn)［22］。相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果與本研究分析的青黛活性成分與靶點(diǎn)蛋白的作用結(jié)果相一致，青黛能減少相關(guān)炎癥蛋白分子對(duì)腸黏膜的破壞，改善胃腸道功能，對(duì)UC 產(chǎn)生治療效果。

3.2 富集與通路分析GO 分類(lèi)分析結(jié)果顯示，青黛有效成分分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，主要通過(guò)對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程及轉(zhuǎn)錄因子活性和DNA結(jié)合等分子功能來(lái)發(fā)揮對(duì)UC的防治作用。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，青黛能影響不同通路，其中IL-17信號(hào)通路、TLRs信號(hào)通路和PI3K/Akt 信號(hào)通路與UC 聯(lián)系密切［23-25］。DEJEA 等研究發(fā)現(xiàn)IL-17 信號(hào)通路與炎癥腸病相關(guān)［26］，施沛青等［27］實(shí)驗(yàn)表明IL-17 具有強(qiáng)大的促炎活性，通過(guò)環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase，COX-2)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放，并可以同腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和干擾素γ(interferonγ，IFN-γ)蛋白分子發(fā)揮協(xié)同作用，放大炎癥反應(yīng)，促進(jìn)UC 發(fā)展。TLRs 信號(hào)通路是天然免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞跨膜受體［28］，TLRs 與接頭蛋白結(jié)合激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)進(jìn)入核內(nèi)，并激活各種炎癥因子轉(zhuǎn)錄，增加樹(shù)突狀T 淋巴細(xì)胞的活性，介導(dǎo)腸道黏膜免疫反應(yīng)［29］，增強(qiáng)腸道黏膜損傷，是UC 患者活動(dòng)期臨床癥狀加重的重要因素［30］。PI3K/Akt 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖分化和凋亡中發(fā)揮重要作用，與UC 發(fā)生關(guān)系密切［31-32］，PI3K/Akt 信號(hào)通路被激活后，具有活性的Akt 會(huì)促使NF-κB 的激活，NF-κB 激活后可增強(qiáng)促炎因子和白細(xì)胞介素的轉(zhuǎn)錄，從而引起一系列炎癥反應(yīng)和黏膜損傷，促進(jìn)UC的發(fā)生和發(fā)展［33］。

4 結(jié)論

本研究以青黛7 種有效成分為研究對(duì)象，探索青黛的靶點(diǎn)和通路，結(jié)果顯示青黛活性成分可能通過(guò)作用于CASP3、PTGS2、JUN 等靶點(diǎn)來(lái)阻斷IL-17 炎癥反應(yīng)通路及TLRs 信號(hào)通路的形成，減少對(duì)腸道黏膜屏障的破壞，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，發(fā)揮對(duì)UC 的治療作用。但本研究尚有不足之處：缺乏實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證；青黛來(lái)源不同，活性成分也有差別；網(wǎng)絡(luò)信息更新不及時(shí)，數(shù)據(jù)滯后，給網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究帶來(lái)局限性。