補腎健脾化瘀中藥對難治/復發再生障礙性貧血患者骨髓CD3+T 淋巴細胞內p-mTOR、p-S6、IFN-γ 表達的影響*

李 錦，華海應△，高華強，朱文艷，周 曄，王志清，張 艷，何廣勝

1 江南大學附屬醫院血液科，江蘇 無錫 214041；2 南京醫科大學第一附屬醫院血液科

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種骨髓造血功能衰竭性疾病，普遍認為AA 是由功能亢進的T 淋巴細胞介導的自身免疫性疾病［1-2］。以免疫抑制治療(immunosuppressive therapy，IST)為主，應用抗人胸腺細胞球蛋白(antithymocyte globulin，ATG)和環孢素(Cyclosporine A，CsA)方案治療，療效約60%～80%，有約30%患者出現復發。目前對于難治/復發AA，除異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）外，尚無統一的有效治療方案[3]，且allo-HSCT找到人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相合供體少，其次受年齡與身體因素影響，適合者很少，這就迫切需要尋找新的治療方法。

AA 屬中醫“虛勞”“血虛”“亡血”等范疇，中醫認為血液的生成、運行和功能狀態與心、肝、脾、腎有關，與脾、腎關系尤為密切［4-5］。江南大學附屬醫院采用中西醫結合治療難治/復發AA 常聯合補腎健脾化瘀中藥，取得了較好療效，但具體機制尚不明確。

我們前期研究發現，補腎健脾化瘀中藥對難治/復發AA 患者骨髓紅系集落形成單位（colony forming unit-erythroid，CFU-E）、紅系爆式集落形成單位（burst forming unit-erythroid，BFU-E）、粒-巨噬細胞集落形成單位(colony forming unit-granulocyte macrophage，CFU-GM)具有促增殖作用［6］，為進一步探討具體作用機制，本研究采用補腎健脾化瘀中藥、雷帕霉素干預難治/復發AA與初發AA患者骨髓造血細胞，運用流式細胞術檢測藥物處理前后各組CD3+T 淋巴細胞內磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、磷酸化核糖體蛋白S6(phosphorylated ribosomal protein S6，p-S6)及干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）的表達水平。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2015 年8 月至2017 年7 月門診與住院的AA患者28例，其中難治/復發AA 15例中女6 例，男9 例；中位年齡24（12～61）歲；初治AA 13 例中女5 例，男8 例；中位年齡21（9～58）歲。應用CsA 或聯合ATG 進行免疫抑制劑治療，治療6個月無效視為難治性AA；AA 經正規免疫抑制劑治療獲得緩解后，患者出現外周血細胞計數下降到緩解中位水平的50%以下，或需要輸注血制品，如輸注紅細胞或（和）血小板視為復發AA。同期選取對照組14 例（缺鐵性貧血7 例，正常骨髓7 例），其中女6 例，男8 例，中位年齡25（11～62）歲。本研究經南通大學第三附屬醫院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 排除標準1）心、肝、肺、腎功能不全；2）合并其他嚴重并發癥；3）合并惡性腫瘤；4）不能耐受骨穿者；5）對研究藥物過敏者。

1.3 研究方法

1.3.1 中藥試劑 黃芪多糖（CAS：89250-26-0；規格：20 mg/瓶）、淫羊藿甙（CAS：489-32-7；規格：50 mg/瓶）、三七總皂甙（CAS：88105-29-7；規格：50 mg/瓶）、人參二醇（CAS：7755-01-3；規格：20 mg/瓶）均由南京景竹生物技術有限公司提供，質量分數分別為：70%、≥85%、90%及95%；巴戟天多糖（CAS：59432-60-9；規格：50 mg/瓶）、菟絲子黃酮（CAS：190801；規格：20 mg/瓶）、黃精多糖（CAS：S27804；規格：50 mg/瓶）、當歸多糖（CAS：A22001；規格：20 mg/瓶）均由陜西斯諾特生物技術有限公司提供，質量分數分別為≥95%、90%、85%、90%。

1.3.2 骨髓采集與分組處理 在無菌條件下采集受試者骨髓液5 mL，緩慢注入含肝素抗凝無菌試管中，并搖勻。將對照組、初發AA、復發/難治AA 3 組受試者骨髓標本分別置于24 孔培養板中，每組設本底組（空白組）、雷帕霉素組和補腎健脾化瘀中藥組。雷帕霉素組加入終濃度25 nmol/L的雷帕霉素；中藥組加入當歸多糖、淫羊藿甙、巴戟天多糖、黃芪多糖、三七總皂甙、黃精多糖各100 μg/mL及菟絲子黃酮、人參二醇各50 μg/mL；空白組加入生理鹽水。每孔1 mL，每組設3 個復孔。每孔分別加入含10%胎牛血清RPMI 1640 培養基至1 mL，置于5%CO2、37 ℃培養箱孵育48 h。

1.3.3 p-mTOR、p-S6、IFN-γ水平檢測 用免疫磁珠分選對照組、初發AA、復發/難治AA各組藥物處理前后（培養箱孵育48 h）骨髓單個核細胞的CD3+T 淋巴細胞，各組加入破膜劑進行T 淋巴細胞破膜，分別加入抗p-mTOR、抗p-S6與FITC-IFN-γ，以CD3+T 淋巴細胞為橫坐標，細胞計數為縱坐標，形成直方圖，獲得5000 個以上CD3+T 淋巴細胞數，上流式細胞儀分析CD3+T 細胞胞漿內的p-mTOR、p-S6及IFN-γ表達，以陽性細胞百分數表示。

1.4 統計學方法應用SPSS 11.0 軟件分析數據，計量資料以D表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用成組設計t檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR 表達實驗中CD3+T 淋巴細胞的純度均為94%以上，藥物處理前，復發/難治AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR表達均高于初發AA及對照組（P＜0.01），而初發AA與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。藥物處理后，復發/難治AA 組中雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥均能降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR 表達（P＜0.01），雷帕霉素與補腎健脾化瘀組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；初發AA 與對照組中，雷帕霉素、補腎健脾化瘀中藥降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR 表達不明顯（P＞0.05）。見表1及圖1。

表1 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內p-mTOR的表達（D）%

表1 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內p-mTOR的表達（D）%

注：*表示與對照組比較，P＜0.01；△表示與復發/難治AA組藥物處理前比較，P＜0.01

圖1 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內p-mTOR的表達（流式細胞）

2.2 CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-S6 的表達藥物處理前，復發/難治AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-S6 表達均高于初發AA 及對照組（P＜0.01），而初發AA與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。藥物處理后，復發/難治AA組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥能降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-S6 表達（P＜0.01），雷帕霉素與補腎健脾化瘀中藥組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；初發AA與對照組中，雷帕霉素、補腎健脾化瘀中藥降低CD3+T淋巴細胞胞漿內p-S6 表達不明顯（P＞0.05）。見表2及圖2。

圖2 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內p-S6的表達（流式細胞）

表2 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內p-S6的表達（D）%

表2 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內p-S6的表達（D）%

注：*表示與對照組比較，P＜0.01；△表示與復發/難治AA組藥物處理前比較，P＜0.01

2.3 CD3+T 淋巴細胞胞漿內IFN-γ 表達藥物處理前，復發/難治AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內IFN-γ表達均高于初發AA及對照組（P＜0.01），初發AA 患者IFN-γ表達高于對照組（P＜0.01）。藥物處理后，復發/難治AA 組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥能降低CD3+T淋巴細胞胞漿內IFN-γ表達（P＜0.01）；初發AA 組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥均能降低CD3+T淋巴細胞胞漿內IFN-γ表達（P＜0.01），雷帕霉素與補腎健脾化瘀中藥組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內IFN-γ表達作用不明顯（P＞0.05）。見表3及圖3。

圖3 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內IFN-γ的表達（流式細胞）

表3 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內IFN-γ的表達（D）%

表3 各組骨髓CD3+T淋巴細胞胞漿內IFN-γ的表達（D）%

注：*表示與對照組比較，P＜0.01；▲表示與初發AA組藥物處理前比較，P＜0.01；△表示與復發/難治AA組藥物處理前比較，P＜0.01

3 討論

腎主骨生髓，藏精，精血互化，腎精虧虛，骨髓失于充養，不能化生氣血，以致唇甲淡白、面色萎黃、氣短、心悸、乏力，腦失滋養，導致耳鳴、頭暈、健忘；骨髓空虛，腰府失養，致使氣虛無力推動血脈運行，腰膝酸軟；血虛則血行不暢，導致離經之血不去，瘀阻絡脈，致使皮膚瘀點或瘀斑；瘀血不去，新血不能生，致病情纏綿難愈。因此腎精虧虛、氣血不足、瘀血內阻是AA 的重要病機，治療宜采用補腎中藥。研究顯示，補腎陰、補腎陽及健脾化瘀中藥治療AA已取得一定療效［7］。臨床用于治療AA 的補腎陽中藥包括菟絲子、淫羊藿、巴戟天等，菟絲子黃酮可通過補腎促進幼年大鼠睪丸支持細胞增殖和分化［8］；用于治療AA 的補腎陰中藥有熟地黃、黃精等，熟地黃多糖、黃精多糖均具有調節免疫功能的作用［9］；淫羊藿苷具有雌激素樣作用，有調節免疫、抗炎、壯陽等功效［10］；巴戟天多糖具有增強機體免疫，改善生殖功能等作用［11］；用于治療AA 的益氣養血中藥有人參、當歸、黃芪等，人參二醇能有效促進造血功能，改善AA 患者骨髓抑制，加快造血功能恢復，升高外周血象，同時通過恢復AA 小鼠失衡的Th1/Th2/Treg 細胞比例而調節免疫功能［12］；黃芪多糖對小鼠有免疫功能調節作用，還可刺激B 細胞的活化與增殖來增高機體體液免疫能力［13］。當歸多糖可防護X 線損傷大鼠骨髓及脾臟，促進血細胞增殖［14-15］；用于治療AA的活血藥物有三七等，三七總皂甙通過促進骨髓與骨髓間充質細胞分化，促進血細胞與間充質細胞生成［16］。

本研究采用補腎健脾化瘀中藥（當歸多糖、淫羊藿甙、巴戟天多糖、黃芪多糖、三七總皂甙、黃精多糖，菟絲子黃酮、人參二醇）兼補腎陰、腎陽，健脾化瘀。本研究發現，藥物處理前，復發/難治AA患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達均高于初發AA 及對照組；藥物處理后，在難治/復發AA 組中，雷帕霉素及補腎健脾化瘀中藥均能降低CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達，雷帕霉素組與補腎健脾化瘀中藥組比較差異無統計學意義。既往研究發現復發/難治AA 患者對CsA 耐藥與CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR/p-S6/IFN-γ異常活化有關，對雷帕霉素敏感與雷帕霉素靶向抑制CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR/p-S6/IFN-γ異常活化有關，雷帕霉素通過不同的機制作用環孢菌素治療免疫介導的AA［17-18］。本研究結果進一步證實了補腎健脾化瘀中藥與雷帕霉素均能通過抑制復發/難治AA患者CD3+T淋巴細胞胞漿內p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達，抑制T 淋巴細胞活性，降低造血負調控因子，促進造血功能重建。此研究結果在國內外未見相關報道，與雷帕霉素比較未顯示明顯優勢，但補腎健脾化瘀中藥可以減少雷帕霉素不良反應，為補腎健脾化瘀中藥臨床治療復發/難治AA 患者提供了一定的理論基礎。

綜上所述，補腎健脾化瘀中藥通過抑制難治/復發AA 患者CD3+T 淋巴細胞胞漿內p-mTOR、p-S6、IFN-γ表達，進而抑制T 淋巴細胞異常激活，改善骨髓造血功能。今后將進一步研究補腎健脾化瘀中藥聯合CsA治療難治/復發AA，判斷補腎健脾化瘀中藥克服CsA 耐藥后的療效是否明顯提高，且具體作用機制及是否通過其他途徑發揮作用也有待進一步研究。