不同濃度紫草素對培養大鼠心肌細胞的毒性作用分析

陳菊英 黃文東 高 琦 練曉珊

（1.廣州泰和腫瘤醫院藥學部，廣東 廣州 510030；2.廣東省茂名市人民醫院藥劑科，廣東 茂名 525099；3.廣州市婦女兒童醫療中心婦產科，廣東 廣州 510600）

心臟可以為血液流動提供動力，是循環系統重要的器官之一，臨床藥物的細胞毒性均可能引起不同程度心臟循環壓力，甚至會造成心功能的惡化。采用MTT法可以檢測臨床藥物對心肌細胞存活率[1]。紫草具有涼血、活血功效的中草藥，有研究發現，從紫草中提取出來的紫草素、乙酰紫草素對細菌、真菌具有明顯的抑制作用。主要通過升高不同類型腎癌細胞中活性氧水平和p38活性來觸發程序性細胞死亡，達到抗炎、抗癌等效果[2]。紫草素對多種腫瘤細胞增殖也有抑制效果，其機制是誘導細胞凋亡和抑制新生血管形成，從而起到抗腫瘤作用[3]。但目前紫草素對心肌毒性的作用尚不清楚，有關的動物實驗和臨床試驗較少。基于此，為探討紫草素對心肌細胞的毒性作用，本研究將采用新生乳鼠的心肌細胞進行研究，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 試驗藥物：紫草素購自廣州市藥檢所，純度＞97%，8mg紫草素溶解于1mL二甲基亞砜（DMSO）中，充分溶解后置于-20℃保存。

1.2 試劑：DMEM培養液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自Science Cell公司；0.25%胰蛋白酶購自杭州吉諾公司；二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司。

1.3 動物：SD大鼠購自中山大學實驗動物中心，本研究經動物倫理委員會批準同意使用。

1.4 心肌細胞的分離和培養：將新生（出生1～3d）大鼠用75%乙醇消毒，取其心臟，將心房和血管組織去除，沖洗心室后將其剪碎，剪成1mm左右組織塊，加入5mL的0.25%胰酶和0.1%EDTA消化液在搖床中搖勻，溫度保持在37℃，以100轉/分搖10min，去除消化液。加入新的胰酶，使用滴管吹打3～5次后搖20min，收集消化液，在重復上述操作3次。收集到的消化液使用15%胎牛血清的DMEM培養基中和，使用消毒后的300目尼龍網過濾。過濾液轉移至50mL離心管中離心4min，棄上清液，收集細胞，使用15%胎牛血清的高糖DMEM培養基重懸細胞后分裝至培養瓶中，置于37℃的CO2培養箱中進行培養。75min后吸出尚未貼壁的細胞懸液，移至培養板的蓋玻片上，24h后換液，清除未貼壁細胞，往后隔2d換液1次，使用顯微鏡觀察細胞形態和生長情況，每天對細胞的自發收縮進行計數和照相。

1.5 MTT檢測：將培養24h后的心肌細胞按每孔5×104個細胞接種于96孔板中，在培養2d后，往每孔加入濃度為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L的紫草素處理，時間分別為48h和72h后，將培養液倒掉，到終點時間時加入2mg/mL的MTT于每孔。37℃培養4h，倒掉MTT溶液，再每孔加入150μL的DMSO液，振蕩10min，充分溶解后使用酶標儀在490處測定各孔的OD值。設立空白對照組和正常對照組，空白對照組即無細胞、培養液和MTT；正常對照組，即有細胞和相同濃度的藥物溶解介質、培養液和MTT。細胞存活率=（OD樣品-OD對照）/（OD對照-OD空白）。

1.6 統計學方法：運用SPSS20.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各濃度紫草素處理48h后心肌細胞毒性OD值比較：與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著（P＜0.05），其他兩個濃度差異無統計學意義（P＞0.05），紫草素為1×10-5mol/L濃度時，OD均值與對照組差異有統計學意義，詳見表1，圖1。

表1 各濃度紫草素處理心肌細胞毒性OD值比較（±s）

表1 各濃度紫草素處理心肌細胞毒性OD值比較（±s）

組別 減去底色的OD值對照組 0.67±0.0510-7紫草素 0.78±0.1510-6紫草素 0.75±0.1210-5紫草素 0.009±0.007

圖1 MTT檢測結果（紫草素處理心肌細胞作用48h）

2.2 各濃度紫草素處理72h后心肌細胞毒性OD值比較：與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著（P＜0.05），其它兩個濃度均差異無統計學意義（P＞0.05），紫草素為1×10-5mol/L濃度時，OD均值與對照組差異有統計學意義，詳見表2，圖2。

圖2 MTT檢測結果（紫草素處理心肌細胞作用72h）

表2 各濃度紫草素處理心肌細胞毒性OD值比較（±s）

表2 各濃度紫草素處理心肌細胞毒性OD值比較（±s）

組別 減去底色的OD值對照組 0.83±0.0610-7紫草素 0.77±0.1210-6紫草素 0.82±0.1010-5紫草素 0.015±0.006

3 討論

近年來，關于中藥提取物對心肌細胞毒性作用的相關研究日趨增多。心肌細胞是研究藥物毒性試驗的試驗對象[4]。紫草素在2010版藥典中，將紫草素作為紫草的含量和質量測定指標[5-6]。中醫上常見紫草作為外用藥物，熬膏或用植物油浸泡涂擦方式用于溫熱斑疹、熱毒蘊結引起的多種皮膚疾病，如燒傷、濕疹、丹毒等[7]。以往學者多認為紫草無毒性或小毒性的天然材料，如《名醫別錄》中認為紫草苦寒無毒[8]。考慮原因是紫草多外用，紫草素進入人體內部的含量相對較少，不會達到有毒的含量。因此，關于紫草素對心肌細胞的毒性尚未清楚。

現代藥理研究證實，紫草素可以抑制炎癥因子、加速癌細胞凋亡以及抗血管新生等作用，但組織中存在的吡咯里西啶生物堿一定的毒性，阻礙了其藥物作用[9-10]。Li等研究表明，紫草素通過激活活性氧（ROS）的產生并抑制細胞內三磷酸腺苷水平、糖酵解相關蛋白和PI3K-AKT-mTOR信號通路，誘導RA-FLS的細胞凋亡和自噬[11]。有研究表示，紫草素在體內實驗中具有較高的毒性作用，不同濃度紫草素的毒性有差異[12-13]。本研究結果顯示，紫草素濃度為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L在48h的心肌細胞處理條件下，與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著，其它兩個濃度均未作出顯著毒性。紫草素濃度為1×10-7mol/L、1×10-6mol/L、1×10-5mol/L在72h的心肌細胞處理條件下，與對照組比較，紫草素1×10-5mol/L濃度作用時，毒性顯著，其他兩個濃度均未作出顯著毒性。提示為紫草素處理濃度小于1×10-6mol/L時，無明顯毒性，當紫草素處理濃度為1×10-5mol/L時作用于大鼠心肌細胞48h、72h后產生了明顯毒性細胞毒性。綜上所述，紫草素具有一定的細胞毒性，紫草素濃度小于1×10-6mol/L時，未表現出明顯毒性，當紫草素濃度為10-5mol/L時處理心肌細胞48h、72h后，對大鼠心肌細胞有明顯毒性。本研究還存在一定的局限性，未做體內實驗，因此心肌細胞采用不同濃度紫草素的體內實驗是否會存在毒性反應還需進一步研究。